張曉旭，陳復(fù)生，張麗芬，辛穎

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001）

大豆是我國的七大糧食作物之一[1]，也是世界上主要的油料作物之一，含有40%左右蛋白質(zhì)，20%左右脂肪，其種植廣泛，以美國的大豆產(chǎn)量列居全球之最[2]。近5年來，我國大豆的年產(chǎn)量在1 200萬噸左右，但是年消費(fèi)量達(dá)到了10 000萬噸左右，對外依存度已高達(dá)80%左右，這些進(jìn)口大豆多為美國、巴西和阿根廷的轉(zhuǎn)基因大豆。

大豆油是轉(zhuǎn)基因大豆的主要消費(fèi)途徑之一，壓榨法、有機(jī)溶劑浸出法和水酶法是常用的提油方法，我國95%以上的大豆油都是使用有機(jī)溶劑浸出法提取[3]，最常見的有機(jī)溶劑是己烷，由于己烷在大豆油和空氣中的殘留會對人體及環(huán)境造成危害[4]，研究者開始探索高出油率的替代工藝，在眾多潛在替代方案中，水酶法[5-6]已經(jīng)得到了普遍關(guān)注。水酶法是在破碎大豆細(xì)胞壁的基礎(chǔ)上，以水為介質(zhì)，對脂蛋白、脂多糖進(jìn)行降解，使油脂釋放出來，其條件溫和、工藝簡單、耗能低，在無污染的前提下，可以同時(shí)提取油和蛋白質(zhì)[7]。為了更大限度的提高大豆出油率，國內(nèi)外學(xué)者對大豆的預(yù)處理方法進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)擠壓膨化預(yù)處理方式展現(xiàn)了明顯的優(yōu)勢，大豆經(jīng)擠壓膨化后脂肪聚集并且充分暴露在表面[8-9]，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也由有序轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序，增加了蛋白對酶攻擊的敏感性[10-11]，同時(shí)，減少了酶解后油與蛋白形成的乳狀物[12-14]。

目前，關(guān)于轉(zhuǎn)基因食品的安全性眾說紛紜，人們依賴轉(zhuǎn)基因大豆帶來的益處的同時(shí)，也在嘗試各種辦法以最大限度的降解轉(zhuǎn)基因大豆的外源基因，以降低轉(zhuǎn)基因食品對人體的影響。王衛(wèi)國等[15]探究微波處理和超高壓處理對轉(zhuǎn)基因大豆外源基因降解的影響，發(fā)現(xiàn)與超高壓處理相比，微波處理對轉(zhuǎn)基因大豆外源基因的降解更加明顯。國內(nèi)外對轉(zhuǎn)基因食品的研究主要集中在轉(zhuǎn)基因成分的檢測及其食用或飼用安全性上[16-18]，而對轉(zhuǎn)基因大豆制油過程中內(nèi)、外源基因的降解狀況鮮有報(bào)道。本課題通過數(shù)字PCR技術(shù)，探索經(jīng)過擠壓膨化后的轉(zhuǎn)基因大豆提油過程中內(nèi)、外源基因的降解變化規(guī)律，為我國轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識制度的監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持，同時(shí)，也為水酶法提取轉(zhuǎn)基因大豆油安全性評價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉(zhuǎn)基因大豆：河南神農(nóng)膨化飼料科技有限公司。

濃鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、異丙醇、氯仿、異戊醇、0.5 mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：均為分析純，購自上海生工生物工程股份有限公司；堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L（2.4 AU/mL）：青島吉寶中新國際貿(mào)易有限公司；RNA酶（Cat.#：2158）、Mix（RR901A）：寶生物工程（大連）有限公司；Tris-HCl：天根生化科技有限公司；十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制；樹脂型油類DNA提取試劑盒：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器設(shè)備

數(shù)顯pH計(jì)（PHS-3C）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6）：常州普天儀器制造有限公司；多功能粉碎機(jī)（ST-07B）：上海樹立儀器儀表有限公司；離心機(jī)（GL-10000C）：上海安亭科學(xué)儀器廠；PCR 儀（FFG02HSD）：Bio-Techne（TECH）公司；超微量蛋白核酸分析儀（BioDrop Duo 80-3006-61）：英國柏點(diǎn)公司；微滴制備儀（QX200）、PCR 儀（T100）、微滴分析儀（QX200 Droplet）：美國BIO-RAD公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

工藝流程見圖1。

圖1 工藝流程圖Fig.1 Flow chart

1.3.2 原料預(yù)處理

將轉(zhuǎn)基因大豆粉碎后，進(jìn)行擠壓膨化預(yù)處理，條件為：套筒溫度70℃～120℃（四段溫度）；物料水分含量15%；主軸轉(zhuǎn)速375 r/min；蒸汽壓力0.5 MPa；?？卓讖? mm。

1.3.3 水酶法提取轉(zhuǎn)基因大豆油的單因素試驗(yàn)

以油脂提取率為目標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)對酶解參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，研究酶解參數(shù)即料液比、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度和酶解pH值，設(shè)置4個因素不變，只改變1個因素，來確定各因素對油脂提取率的影響。各因素的范圍如下：pH 8.0～10.5，加酶量1.4%～2.2%，酶解時(shí)間 2 h～4.5 h，酶解溫度 40℃～65℃，料液比 1 ∶4（g/mL）～1 ∶8（g/mL）。

1.3.3.1 最適料液比的確定

取50 g擠壓膨化過的轉(zhuǎn)基因大豆粉（過80目篩）于錐形瓶中，加入料液比分別為 1 ∶4、1 ∶5、1 ∶6、1 ∶7、1∶8（g/mL）的蒸餾水，混勻，以1 mol/L的NaOH或HCl調(diào)整其pH值至9，加入2.0%的堿性蛋白酶，反應(yīng)時(shí)間為4 h[16]，置50℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)，并用加速電動攪拌器不斷攪拌，使pH值穩(wěn)定在9不變。反應(yīng)結(jié)束后，于95℃上加熱10 min滅酶，5 000 r/min離心20 min。收集上層游離油放置在棕色玻璃瓶中，放入4℃冰箱內(nèi)保存。通過提油率確定酶的最佳料液比，每個試驗(yàn)做3個平行。

1.3.3.2 最適加酶量的確定

按1.3.3.1中操作步驟，根據(jù)確定的最佳料液比，將加酶量分別設(shè)置為 0、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%。通過提油率確定最適加酶量。

1.3.3.3 最適酶解時(shí)間的確定

按1.3.3.1中操作步驟，根據(jù)確定的最佳料液比、加酶量，將反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h。通過提油率確定酶的最佳酶解時(shí)間。

1.3.3.4 最適酶解溫度的確定

按1.3.3.1中操作步驟，根據(jù)確定的最佳料液比、加酶量、酶解時(shí)間，將酶解溫度分別設(shè)置為35、40、45、50、55℃。通過提油率確定酶的最佳酶解溫度。

1.3.3.5 最適酶解pH值的確定

按1.3.3.1中操作步驟，根據(jù)確定的最佳料液比、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度，將酶解pH值分別設(shè)置為 8.5、9.0、9.5、10.0、10.5。通過提油率確定酶的最佳酶解pH值。

1.3.4 分析檢測方法

1）水分的測定：參照GB/T 10362-2008《糧油檢驗(yàn)玉米水分測定》。

2）粗脂肪的測定：參照NY/T 4-1982《谷類、油料作物種子粗脂肪測定方法》。

3）粗蛋白質(zhì)的測定：參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》。

4）灰分的測定：參照GB 5009.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》。

5）轉(zhuǎn)基因大豆提油率：

1.3.5 樣品DNA的提取

擠壓膨化后的轉(zhuǎn)基因大豆、水酶法處理擠壓膨化過的轉(zhuǎn)基因大豆后得到的水相和渣采用SDS法[19]（水相取1 mL，不加SDS，其他步驟一樣）提取DNA。

油相試劑盒嚴(yán)格按照說明書操作提取DNA。

1.3.6 引物及探針

數(shù)字PCR的引物及探針見表1。

表1 數(shù)字PCR的引物及探針Table 1 Primers and probes for digital PCR

1.3.7 數(shù)字PCR反應(yīng)體系及程序

數(shù)字PCR的反應(yīng)體系見表2，反應(yīng)程序見表3。

表2 數(shù)字PCR的反應(yīng)體系Table 2 Reaction system of digital PCR

表3 數(shù)字PCR的反應(yīng)程序Table 3 Reaction procedure of digital PCR

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 8.5軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因大豆基本成分測定

轉(zhuǎn)基因大豆的基本成分見表4。

表4 轉(zhuǎn)基因大豆基本成分Table 4 Nutrient composition of genetically modified soybean

如表4所示，經(jīng)過測定，轉(zhuǎn)基因大豆的粗脂肪含量為21.013%左右，這與實(shí)際相符。除上述測定的成分之外，大豆還含有部分的碳水化合物以及微量元素等。

2.2 水酶法提取轉(zhuǎn)基因大豆油單因素試驗(yàn)結(jié)果

各因素對轉(zhuǎn)基因大豆提油率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 各因素對轉(zhuǎn)基因大豆提油率的影響Fig.2 Effect of various factors on oil extraction rate of genetically modified soybean

各因素對水酶法提取轉(zhuǎn)基因大豆的提油率影響不同。由圖2A所示，隨著液體量增大，轉(zhuǎn)基因大豆的提油率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)料液比為1∶6（g/mL）時(shí)，提油率最大。這可能是由于水的加入，使蛋白質(zhì)更大程度的溶出，從而酶解效率提高，提油率呈現(xiàn)增加的趨勢；但是，加水量到一定程度后，溶液的整體濃度降低，酶與底物的濃度也降低，這使得酶分子與底物分子的碰撞幾率減小，從而酶解效率降低，提油率呈現(xiàn)降低的趨勢。圖2B中，隨著加酶量的增加，轉(zhuǎn)基因大豆油的提油率呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，當(dāng)加酶量大于1.8%時(shí)，提油率開始穩(wěn)定。這是由于加酶量的增加，有利于蛋白質(zhì)的降解，從而使提油率增加；但當(dāng)加酶量超過一定程度時(shí)，底物被酶飽和，再增加加酶量，對酶解效果影響不大，從而提油率趨于穩(wěn)定。圖2C中，隨著酶解時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)基因大豆油的提油率呈現(xiàn)先顯著增加，后趨于穩(wěn)定的趨勢。這是由于隨著酶解時(shí)間的增加，酶解愈加徹底，所以提油率隨之增加；但是當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到4.0 h后，由于底物的減小，酶濃度的減小，抑制作用增加，這時(shí)再增加酶解時(shí)間，油脂也不再進(jìn)一步釋放，提油率趨于穩(wěn)定。圖2D中，隨著酶解溫度的提升，提油率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。這是由于溫度升高，分子運(yùn)動速度加快，酶分子與底物分子的碰撞幾率增加，所以酶解效率增加，提油率隨之增加；但是，當(dāng)溫度升到35℃時(shí)，酶會發(fā)生變性，其活性中心會部分或者完全喪失催化活性，這時(shí)，酶解效率就會下降，提油率也隨之下降。圖2E中，隨著酶解pH值的增加，轉(zhuǎn)基因大豆的提油率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。這是由于每一種酶都存在最適pH值的范圍，當(dāng)反應(yīng)體系的pH值接近這個范圍時(shí)，呈現(xiàn)的酶解效果最佳，從而提油率隨之增加；但是，當(dāng)反應(yīng)體系的pH值超過9.0時(shí)，酶解效果就相對降低，從而提油率隨之降低。因此提取的最佳工藝條件為：加酶量1.8%、酶解溫度35℃、酶解時(shí)間4.0 h、酶解 pH9.0、料液比 1 ∶6（g/mL）。

2.3 DNA提取結(jié)果

樣品DNA提取結(jié)果見表5。

表5 樣品DNA提取結(jié)果Table 5 DNA extraction results of each sample

DNA的純度主要取決于其在260 nm和280 nm處的吸光度，高質(zhì)量DNA的A260/A280介于1.8～2.0之間，滿足這一條件的DNA在進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增的時(shí)候，才可以最大可能的排除假陰性結(jié)果。如表5所示，用核酸測定儀分別測定所提DNA的A260/A280，經(jīng)過擠壓膨化后的轉(zhuǎn)基因大豆粉、水酶法反應(yīng)后得到的水相、油相和渣的A260/A280都在1.8～2.0之間，這說明所提DNA適用于后續(xù)的PCR反應(yīng)。

2.4 數(shù)字PCR檢測結(jié)果

微滴式數(shù)字PCR儀測定各樣品的Lectin基因圖和EPSPS基因圖見圖3和圖4，分析結(jié)果見表6。

圖3 微滴式數(shù)字PCR儀測定各樣品的lectin基因圖Fig.3 Detection of lectin gene by digital PCR

圖4 微滴式數(shù)字PCR測定各樣品的EPSPS基因圖Fig.4 Detection of EPSPS gene by digital PCR

1 g擠壓膨化后的轉(zhuǎn)基因大豆經(jīng)過水酶法（按照單因素結(jié)果進(jìn)行酶解）離心得到約4.1 g的水相、0.8 g的固相、0.1 g油相，由于0.1 g膨化后的轉(zhuǎn)基因大豆、0.1 g水酶法得到的水相（密度為1.029 8 g/mL）以及0.1 g固相中所提的DNA體積為200 μL，水酶法得到的3 mL油相（密度為0.9010g/mL）中所提的DNA體積為20μL，以膨化過的轉(zhuǎn)基因大豆為例：針對Lectin基因，1 μL DNA最終拷貝數(shù)為73 600，0.1 g膨化后的轉(zhuǎn)基因大豆所提的DNA體積為200 μL，則0.1 g膨化后的轉(zhuǎn)基因大豆含有的Lectin基因的最終拷貝數(shù)為147.2×105，那么1 g擠壓膨化后的轉(zhuǎn)基因大豆含有的Lectin基因的最終拷貝數(shù)為147.2×106，以此類推經(jīng)過換算：1 g膨化后的轉(zhuǎn)基因大豆含EPSPS基因的拷貝數(shù)為38×106；經(jīng)過擠壓膨化得到的4.1 g水相中Lectin基因的拷貝數(shù)為95.776×106，占總拷貝數(shù)的65.065 2%，EPSPS基因的拷貝數(shù)為31.062×106，占總拷貝數(shù)的81.742 1%；0.8 g固相中Lectin基因的拷貝數(shù)為24.832×106，占總拷貝數(shù)的16.892 5%，EPSPS基因的拷貝數(shù)為4.288×106，占總拷貝數(shù)的11.2 842%；0.1 g油相中Lectin基因的拷貝數(shù)為252，占總拷貝數(shù)的0.000 2%，EPSPS基因的拷貝數(shù)為139，占總拷貝數(shù)的0.000 4%。總體上，在水酶法提油過程中，無論是轉(zhuǎn)基因大豆內(nèi)源Lectin基因，還是外源EPSPS基因主要分布在水相中，這是由于DNA溶于水；其次分布于固相中，這是由于離心力的作用，使部分DNA沉淀于固相中，從而油相中DNA分布最少。轉(zhuǎn)基因大豆內(nèi)源Lectin基因與外源EPSPS基因相比，外源EPSPS基因更易溶于水相。水酶法所得的油相中外源EPSPS基因所占比例與內(nèi)源Lectin基因所占比例相差不大，水酶法工藝過程并不能使所得油脂中的外源EPSPS基因降解完全，由此可知，盡管水酶法所得的油脂中DNA含量很低，但是外源EPSPS基因仍然存在。

表6 數(shù)字PCR分析結(jié)果Table 6 Results of digital PCR

總體而言，水酶法工藝過程過于溫和，不能使轉(zhuǎn)基因大豆的內(nèi)、外源基因發(fā)生明顯降解，但是由結(jié)果可知：水酶法提取得到水相中內(nèi)、外源基因的含量最大，其次是固相中，大豆油中內(nèi)、外源基因的含量微乎其微，但依然可以檢出。同時(shí)，水酶法所得水相、固相、油相的內(nèi)源Lectin基因拷貝數(shù)之和占總拷貝數(shù)的81.957 9%，其EPSPS基因拷貝數(shù)之和占總拷貝數(shù)的93.026 7%，使得水酶法得到的水相、固相和油相中的基因含量總和不足100%，這說明除去誤差，也有部分內(nèi)、外源基因發(fā)生了降解，但是總體而言，轉(zhuǎn)基因大豆內(nèi)源Lectin基因降解量大于外源EPSPS基因，由此可知，轉(zhuǎn)基因大豆的外源EPSPS基因相比內(nèi)源Lectin基因更加穩(wěn)定，不易發(fā)生降解。

3 結(jié)論

大豆經(jīng)擠壓膨化后，其細(xì)胞壁得到充分的破壞，脂肪聚集并且充分暴露在表面，有利于水酶法對油脂進(jìn)行提取。離心分離后，游離油與水相分界明顯，可以直接對游離油進(jìn)行收集，打破了常規(guī)以離心殘?jiān)袣堄吐蕿橹笜?biāo)的提油率計(jì)算方法。

以擠壓膨化過的轉(zhuǎn)基因大豆粉為原料，以清油得率為指標(biāo)，對酶解溫度、時(shí)間、pH值、加酶量以及料液比進(jìn)行優(yōu)化，通過單因素試驗(yàn)，確定水酶法提取轉(zhuǎn)基因大豆油的最佳工藝條件為：加酶量1.8%、酶解溫度35℃、酶解時(shí)間4.0 h、酶解pH 9.0、料液比1∶6（g/mL）。

采用數(shù)字PCR對水酶法提取轉(zhuǎn)基因大豆油得到的水相、固相和油相中內(nèi)、外源基因進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)水酶法得到的水相中轉(zhuǎn)基因大豆的內(nèi)源基因占65.065 2%，外源基因占81.7421%；固相中內(nèi)源基因占16.892 5%，外源基因占11.284 2%；油相中內(nèi)源基因占0.000 2%，外源基因占0.000 4%。