薛艷潔，潘 娜，李明云

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室，寧波 315211)

光唇魚是鯉形目、鯉科、鲃亞科、光唇魚屬魚類的統(tǒng)稱，分布于我國浙江、江蘇、安徽、福建省及臺灣等地的溪流中。光唇魚因觀賞價值比較高，再加之細(xì)嫩的肉質(zhì)、鮮美的味道，廣受消費人群的歡迎[1]。目前，對于光唇魚的研究主要側(cè)重于形態(tài)學(xué)特征[2]、分類學(xué)[3]、組織學(xué)[4]等方面，而迄今為止分子生物學(xué)方面的研究甚少[5]。對于光唇魚屬魚類的分類地位基本上都是根據(jù)形態(tài)特征來鑒別。傳統(tǒng)的依據(jù)形態(tài)特征判定物種的方法難以排除因環(huán)境因子、種內(nèi)個體變異以及雌雄兩性差異等干擾引起的物種變異，仍存在一定的局限性。借助線粒體DNA(mtDNA)對光唇魚屬魚類進(jìn)行分析，可進(jìn)一步在分子層面上證實其形態(tài)學(xué)分類的正確性，確定其系統(tǒng)發(fā)育地位。

線粒體DNA分子結(jié)構(gòu)簡單、幾乎不發(fā)生重組、呈母系遺傳、進(jìn)化速度快，目前在系統(tǒng)進(jìn)化、分類學(xué)、群體遺傳以及動物保護(hù)生物學(xué)等研究方面得到了普遍的應(yīng)用[6-7]。近年來常用的分子標(biāo)記有Cytb、ND、COI、COⅡ和D-loop等。細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅱ(cytochrome oxidase subunitⅡ，COⅡ)是線粒體的編碼基因之一，其基因進(jìn)化的速率較快，基因序列和氨基酸序列的趨異性顯著[8]，目前COⅡ基因研究主要集中在昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)，而在魚類的系統(tǒng)進(jìn)化中的報道較少[9-12]。D-loop區(qū)域(displacement loop region)在mtDNA基因組中的堿基突變率最高，長度變異最大，其堿基替換率比mtDNA基因組的其他區(qū)域高5～10倍，因此，D-loop區(qū)域比較適合于近緣種以及種內(nèi)不同群體之間的遺傳差異分析[13]。本文結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，擴(kuò)增和測定了采自江西贛州安南的光唇魚的COⅡ和D-loop序列，并通過mtDNA分子標(biāo)記分析其系統(tǒng)發(fā)育地位，研究結(jié)果可以為光唇魚屬魚類的分類研究等方面提供參考依據(jù)，同時可以為江西贛州安南光唇魚的漁業(yè)資源的開發(fā)研究提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為江西贛州安南采捕的野生光唇魚，實驗樣本共7尾，采捕后進(jìn)行活體標(biāo)記(HT157型動物標(biāo)簽)，剪取少量尾鰭，經(jīng)液氮速凍后，置于-80℃保存，用于DNA的提取。

1.2 方法

觀察實驗樣本的外部形態(tài)特征，并對其進(jìn)行常規(guī)參數(shù)的測量(頭長、體高、吻長、眼后頭長、眼間距、眼徑、背鰭式、臀鰭式、側(cè)線鱗、鰓耙)。

DNA提取采用常規(guī)的酚-氯仿法進(jìn)行[14]，DNA樣品加20 μL TE緩沖液溶解，于-20℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

COⅡ擴(kuò)增引物根據(jù)溫州光唇魚線粒體全序列(GenBank登錄號：NC_020145)設(shè)計(上游引物序列：5′-GTCTTTTAGCCCCAAGCT-3′；下游引物：5′-GTCTGANGTCACCAATCT-3′)。D-loop擴(kuò)增引物使用黃志堅等[15]設(shè)計的魚類引物序列(上游引物序列：5′-CACCCYTRRCTCCCAAAGCYA-3′；下游引物序列：5′-GGTGCGGRKACTTGCATGTRTAA-3′)。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

PCR擴(kuò)增體系如表1所示。PCR擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性300 s；94℃變性40 s，退火60 s(COⅡ退火溫度為48℃，D-loop退火溫度為57℃)，72℃延伸60 s，30個循環(huán)；72℃再延伸600 s。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測用1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

PCR產(chǎn)物的回收使用膠回收試劑盒(上海博彩生物科技有限公司)，回收后與pMD-19載體(TaKaRa)連接，隨后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，于含氨芐青霉素的平板上烘箱過夜培養(yǎng)(37℃)，挑取陽性克隆產(chǎn)物進(jìn)行測序[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

表1 PCR擴(kuò)增體系Table 1 PCR amplification system

利用Clustal X軟件對所得到的江西贛州安南光唇魚COⅡ、D-loop序列與GenBank中獲取的其他鲃亞科魚類COⅡ和D-loop序列進(jìn)行序列多重對位排列和手工校正[16]；利用MEAN 4.0軟件分析各序列的堿基含量和變異情況[17]，序列遺傳距離的計算利用Kimura 2-parameter模型。分別以斑馬魚(Danio rerio，GenBank登錄號：NC_002333)的COⅡ序列和D-loop序列為外群，構(gòu)建最大似然法(ML)分子系統(tǒng)樹，bootstrap 1000次檢查各分支的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

經(jīng)過觀察，采集的江西贛州安南野生光唇魚體長而側(cè)扁，腹部較圓，背部上半部分呈灰黑色，下半部分呈黃色，腹面呈黃色或者黃白色相間。鼻孔前略成凹陷，頭長(2.5±0.2)cm小于體高(2.7±0.3)cm。吻稍尖，吻長約等于眼后頭長。須兩對，口角須略長，吻須稍短；眼間隆起，間距(1.2±0.1)cm遠(yuǎn)大于眼徑(0.5±0.1)cm。唇肉質(zhì)肥厚，下唇分兩側(cè)瓣，唇后溝較深，向前延伸至頦部，接近下頜中線，而上唇包于上頜外，較完整。光唇魚的背鰭式為DⅡ-9，背鰭末跟不分枝，背鰭第一根分支鰭條與腹鰭起點相對；臀鰭式為A-6或A-7；側(cè)線鱗為39-41(6/A4)；鰓耙為10-13，體側(cè)沒有6條垂直條紋。

圖1 基于線粒體DNA COⅡ序列構(gòu)建的鲃亞科最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Phylogenetic tree (NJ) based on COⅡ gene fragments of Barbinae Bootstrap=1000注：JXAnnan-江西贛州安南光唇魚

2.2 COⅡ和D-loop序列的組成和遺傳距離

經(jīng)過測序，在江西贛州安南光唇魚中，COⅡ引物的擴(kuò)增產(chǎn)物序列長度為775 bp，COⅡ基因序列的全長均為691 bp；7尾江西贛州安南光唇魚的COⅡ序列相似度為99.81%，共存在6個堿基轉(zhuǎn)換位點，其中包括4個T/C轉(zhuǎn)換位點和2個A/G轉(zhuǎn)換位點。江西贛州安南光唇魚COⅡ序列中堿基A、T、G、C的平均組成含量分別為31.00%、25.80%、15.30%和27.90%，A+T的含量(56.80%)要高于G+C的含量(43.20%)。

D-loop引物在江西贛州安南光唇魚中的擴(kuò)增產(chǎn)物序列長度為1116～1123 bp，D-loop基因序列的全長為937～944 bp；7尾江西贛州安南光唇魚的D-loop序列相似度為99.11%，共存在16個堿基轉(zhuǎn)換(A/G、T/C)位點和8個堿基插入或者缺失(A、T)位點。江西贛州安南光唇魚D-loop序列中堿基A、T、G、C的平均組成含量分別為35.60%、32.30%、12.00%和20.00%，A+T的含量(67.90%)要大于G+C的含量(32.00%)。

COⅡ和D-loop序列的測序結(jié)果顯示，兩者序列中堿基G的含量較其他3種堿基明顯偏低，堿基的組成偏向性較明顯。

江西贛州安南光唇魚的COⅡ基因編碼的氨基酸數(shù)量均為230個，其中都含有一個起始密碼子ATG和不完全的終止密碼子T。群體內(nèi)COⅡ、D-loop基因的平均遺傳距離分別為0.0075、0.0050。與其他鲃亞科魚類的遺傳距離分析結(jié)果顯示，江西贛州安南光唇魚與半刺光唇魚的遺傳距離最近，COⅡ、D-loop序列遺傳距離分別為0.0130、0.0260。

圖2 基于線粒體DNA D-loop序列構(gòu)建的鲃亞科最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree (NJ) based on D-loop gene fragments of Barbinae Bootstrap=1000注：JXAnnnan-江西贛州安南光唇魚

2.3 基于COⅡ和D-loop序列的江西贛州安南光唇魚系統(tǒng)發(fā)育分析

江西贛州安南光唇魚以及其他鲃亞科魚類基于COⅡ序列的最大似然法(ML)分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹如圖1，結(jié)果顯示：光唇魚屬和白甲魚屬的13種魚聚為一大簇；贛州安南光唇魚與半刺光唇魚聚為一小簇，其COⅡ序列同源性為98.70%；然后與薄頜光唇魚、光唇魚、溫州光唇魚聚成一大簇；寬口光唇魚、稀有白甲魚和高體白甲魚三者則單獨聚為一簇，然后與寬口光唇魚、多彩鲃、臺灣鏟頜魚、白甲魚、粗須白甲魚、小口白甲魚和多鱗白甲魚聚為一大簇。

江西贛州安南光唇魚以及其他鲃亞科魚類基于D-loop序列的最大似然法(ML)分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹如圖2。結(jié)果顯示：光唇魚屬和白甲魚屬分別相聚后再聚為一簇，而臺灣鏟頜魚、稀有白甲魚和白甲魚也聚在光唇魚屬的簇中；江西贛州安南光唇魚與半刺光唇魚聚為一簇，其D-loop序列同源性為98.69%。另外，其他鲃亞科魚類無須魮屬、金線鲃屬、突吻魚屬、鱸鯉屬各魚類和倒刺鲃屬的中華倒刺鲃分別聚在一起后形成一簇，與光唇魚屬和白甲魚屬形成一大簇。

3 討論

光唇魚屬魚類的鑒定長期以來主要是依據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，通過觀察比較體色、口唇結(jié)構(gòu)、背鰭等形態(tài)特征差異來進(jìn)行分類。對比同族的其他屬，光唇魚屬的主要差別在于：吻有褶；唇肉質(zhì)，包于上下頜外，上下唇相連在口角處；下唇兩側(cè)瓣之間有間隔；口下位；下頜前緣有角質(zhì)；兩對須；背鰭尾部不分支，鰭條骨化，后緣則光滑或有鋸齒[19]。本研究對江西贛州安南的野生光唇魚進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果顯示其吻稍尖，須兩對，眼間隆起，唇肉質(zhì)肥厚，下唇分兩側(cè)瓣，唇后溝較深，向前延伸至頦部，接近下頜中線，而上唇包于上頜外，較完整，背鰭末跟不分枝，背鰭第一根分支鰭條與腹鰭起點相對。根據(jù)伍獻(xiàn)文[19]、毛節(jié)榮[20]、單鄉(xiāng)紅[21]、袁樂洋[3]等的描述可以確定該魚類為光唇魚屬魚類，與半刺光唇魚的形態(tài)最為相似，但仍不能確定具體種。由于光唇魚屬魚類在兩性差異、不同地理群體以及體色上有很大的不同，所以在進(jìn)行物種鑒定時容易產(chǎn)生鑒定錯誤。有些光唇魚屬魚類幼魚體側(cè)存在垂直條紋，而成魚則垂直條紋消失或者少數(shù)在魚體后半部分有1～3條垂直條紋。例如兩個亞屬的模式種，厚唇光唇魚和臺灣光唇魚，兩者均分布于臺灣島諸水系，除口唇結(jié)構(gòu)的差別外，兩者在體色、吻端及眼眶骨前緣有無珠星等性狀均存在差別，而這些性狀的差別和同屬的其他魚類所表現(xiàn)出來的雌雄之間的差別基本一致[3]。

利用線粒體DNA(mtDNA)的分子分類學(xué)方法對物種進(jìn)行親緣關(guān)系探討以及系統(tǒng)進(jìn)化分析，可以有效避免由于肉眼形態(tài)特征觀察以及地理種群不同帶來的誤差，對物種確定很有必要[22-23]。董徐輝等[12]測定分析了日本鬼鲉(Inimicusjaponicus)的COⅡ基因與鲉形目魚類進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，其結(jié)果與傳統(tǒng)分類方法的基本一致。任巍等[24]測序和分析了掛榜山小鯢(Hynobiusguabangshanensis)線粒體D-loop區(qū)，并構(gòu)建了分子系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示掛榜山小鯢與小鯢屬同屬一個分支，其結(jié)果與Zhang等[25]提交的中國小鯢聚為一小支，與傳統(tǒng)分類學(xué)方法的結(jié)果無異分析，均認(rèn)為掛榜山小鯢屬于小鯢科小鯢屬。

本研究對江西贛州安南采捕的野生光唇魚進(jìn)行COⅡ和D-loop序列的擴(kuò)增以及測序，并與已經(jīng)發(fā)布的鲃亞科魚類進(jìn)行COⅡ和D-loop序列比對分析以及系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建。結(jié)果顯示贛州安南光唇魚則和半刺光唇魚形成一個緊密的簇，贛州安南光唇魚與半刺光唇魚的COⅡ、D-loop序列遺傳距離分別為0.0130、0.0260，序列相似性分別為98.70%、98.69%，而NEI[26]認(rèn)為種群間遺傳距離小于0.0500為同一物種，因此可推斷贛州安南光唇魚和半刺光唇魚為同一種。

此外，在應(yīng)用兩個片段序列進(jìn)行鲃亞科系統(tǒng)發(fā)育分析時發(fā)現(xiàn)，D-loop比COⅡ進(jìn)化速率稍快，選擇壓力更小些，在研究親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種種間關(guān)系時，D-loop優(yōu)于COⅡ。形態(tài)學(xué)特征的觀察結(jié)果顯示江西贛州安南采捕的野生魚類屬于光唇魚屬魚類，與半刺光唇魚最為相似，同時結(jié)合D-loop和COⅡ的2種分子標(biāo)記的結(jié)果更加準(zhǔn)確的判定了其與半刺光唇魚為同一種。這為光唇魚屬所有物種在內(nèi)的分子系統(tǒng)發(fā)育分析提供了資料，也為江西贛州安南光唇魚的開發(fā)利用提供了很好的基礎(chǔ)。

另外，在分析COⅡ和D-loop的系統(tǒng)發(fā)育樹時發(fā)現(xiàn)光唇魚屬和白甲魚屬魚類關(guān)系比較近，多彩鲃(A.barbodon)和寬口光唇魚(A.monticola)與白甲魚屬魚類聚在一簇上。而袁樂洋[3]從光唇魚屬中移除了寬口光唇魚(A.monticola)和多耙光唇魚(A.clivosius)，因此對于多彩鲃(A.barbodon)和寬口光唇魚(A.monticola)分類地位有待于進(jìn)一步研究。