王崇龍,曹智欽，覃小華，李郁梅，衛(wèi)功元

(蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院， 江蘇 蘇州 215123)

萜類化合物(terpenoids)是自然界中種類龐大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的天然產(chǎn)物,已鑒定的種類超過50 000 種。其中，許多種類具有特殊的生理功能或極高的經(jīng)濟(jì)價值,因而被開發(fā)利用,如用作抗腫瘤和消炎止痛的藥物、高級香料、環(huán)保殺蟲除草劑等[1]。現(xiàn)在，隨著化石能源資源枯竭和人們環(huán)境變化的關(guān)注日益加強，研究人員積極尋求新能源以替代傳統(tǒng)的化石能源。許多萜烯(烴)具有媲美汽油、重油和航空燃油的物理和化學(xué)特性，被認(rèn)為是可直接替代傳統(tǒng)化石燃料的新一代生物燃料。異戊二烯(isoprene)半萜更是可以直接用來生產(chǎn)天然橡膠的基質(zhì)原料。因此，萜類化合物涉及醫(yī)藥、環(huán)境、農(nóng)業(yè)和能源等領(lǐng)域，在人類健康生活和生產(chǎn)活動中發(fā)揮著重要作用。

然而，萜類化合物作為次生代謝產(chǎn)物，在天然原料(如植物體)中的含量極其有限。例如，抗瘧藥物青蒿素(artemisinin)的含量僅為青蒿(ArtemisiaannuaL.)葉片干質(zhì)量的0.1%～1%[2]；1株100年樹齡的紅豆杉(Taxusbrevifolia)僅可提取約260 mg泰素，而治療1個癌癥病人約需要消耗2～4株此種珍稀植物[3-4]。因此，從天然原料中萃取分離萜類化合物的產(chǎn)量難以滿足市場需求，使得供需關(guān)系失衡。此外，這種“殺雞取卵式”的生產(chǎn)方式會消耗大量現(xiàn)存的珍稀生物資源，造成不可挽回的生態(tài)危機(jī)。直接化學(xué)合成法又因萜類化合物本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，使得化學(xué)合成步驟非常繁瑣，且得率極低。例如，泰素從頭化學(xué)合成需要經(jīng)過35～51個步驟，最高得率僅為0.4%[3]。如此低的產(chǎn)量不能滿足社會對大宗原料物質(zhì)(如生物能源等)的需求。模式微生物大腸桿菌(Escherichiacoli)具有生長周期短、遺傳背景清晰、遺傳操作簡單成熟和易于擴(kuò)大化培養(yǎng)等優(yōu)點，同時，現(xiàn)在新技術(shù)(如親和膜法)的發(fā)展使得有效去除內(nèi)毒素技術(shù)日臻成熟。因此，開發(fā)大腸桿菌微細(xì)胞工廠，利用廉價的碳源或培養(yǎng)基生產(chǎn)此類具有高附加值和廣泛用途的萜類化合物，被認(rèn)為是一條可持續(xù)發(fā)展的替代途徑，受到生物工程師的青睞[5-6]。

近年來，越來越多的萜類合成路徑得以從植物、細(xì)菌和真菌等物種中解析，伴隨著合成生物學(xué)(synthetic biology)和代謝工程(metabolic engineering)技術(shù)的發(fā)展[7-8]，在大腸桿菌中重構(gòu)萜類合成通路和工程化改造取得了顯著成效，極大地提高了萜類化合物的合成積累能力。這為進(jìn)一步深入研究萜類化合物的生物合成和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好基礎(chǔ)。微生物工廠生產(chǎn)萜類，其產(chǎn)量主要依賴于尋找高效的萜類合成酶，增加前體物的合成供應(yīng)，代謝通量的調(diào)節(jié)及細(xì)胞底盤的編輯等[9-10]。

本文中，筆者對基本結(jié)構(gòu)單元異戊二烯焦磷酸(IPP)和其異構(gòu)體雙甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)主干合成途徑(stem pathway)以及多樣性萜類化合物的枝端合成途徑(branch pathway)進(jìn)行綜述，總結(jié)近幾年來搭建大腸桿菌微細(xì)胞工廠生產(chǎn)各類萜類化合物所采用的優(yōu)化策略，展望合成生物學(xué)和代謝工程領(lǐng)域新興技術(shù)的可能方向，為理性設(shè)計大腸桿菌微細(xì)胞工廠提供借鑒，推動最終實現(xiàn)萜類化合物的高效高產(chǎn)和工業(yè)化。

1 萜類化合物的合成途徑解析

1.1 IPP和DMAPP基本結(jié)構(gòu)單元的合成途徑

盡管萜類化合物有著復(fù)雜多樣的結(jié)構(gòu)，它們均起始于2個五碳(C5)的基本結(jié)構(gòu)單元IPP和DMAPP。自然界中存在2條主要的IPP/DMAPP合成途徑(圖 1)：2-甲基赤蘚醇磷酸(MEP)途徑，主要存在于原核生物及植物質(zhì)體中；甲羥戊酸(MVA)途徑，主要存在于真核生物和少量細(xì)菌中[11-12]。

圖1 合成IPP和DMAPP前體的MEP通路和MVA通路及相關(guān)酶Fig.1 MEP and MVA pathways for precursor synthesis of IPP and DMAPP,and associated enzymes

在MEP途徑中，5-磷酸脫氧木酮糖(DXP)合成酶(Dxs)利用焦磷酸硫胺素(TPP)作為輔因子，首先縮合糖酵解中間產(chǎn)物甘油醛-3-磷酸(G-3-P)和丙酮酸(pyruvate)生成 DXP；進(jìn)而在NADPH存在的條件下，經(jīng)DXP還原異構(gòu)酶(Dxr)催化還原生成MEP(此合成途徑也因而以該重要的中間產(chǎn)物命名)。此兩步催化反應(yīng)被認(rèn)為是MEP途徑中最為重要的限速反應(yīng)。隨后，在2-甲基赤蘚醇磷酸胞苷酰基轉(zhuǎn)移酶(IspD)的催化下，MEP與CTP相作用生成4-二磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤藻糖醇(CDP-ME)；CDP-ME激酶(IspE)利用ATP將CDP-ME磷酸化生成4-二磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤藻糖-2-磷酸(CDP-MEP)；CDP-MEP再經(jīng)過2-C-甲基赤蘚糖醇-2,4-環(huán)二磷酸(MEcPP)合成酶(IspF)的催化作用，裂解和環(huán)化生成MEcPP并釋放出CMP。最后，MEcPP經(jīng)(反)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯焦磷酸(HMBPP) 合成酶(IspG)還原催化作用開環(huán)生成HMBPP，經(jīng)HMBPP還原酶(IspH)對HMBPP進(jìn)一步還原，按約1∶ 5的摩爾比生成DMAPP 和IPP。此外，IPP/DMAPP異構(gòu)酶(IDI)可以催化實現(xiàn)2種異構(gòu)體之間的轉(zhuǎn)換。

在MVA途徑中，3分子起始底物乙酰輔酶A(acetyl-CoA)在硫解酶(THL)和β-羥基-β-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)合成酶(HMGS)的催化下生成HMG-CoA,HMG-CoA還原酶(HMGR)在NAPDH存在的情況下催化還原HMG-CoA生成MVA。此還原步驟是一個不可逆反應(yīng)和MVA合成的限速反應(yīng)。接著，MVA在ATP存在的情況下被MVA激酶(MK)磷酸化其5′-OH位，生成甲羥戊酸-5-磷酸(MVA-5-P)，繼續(xù)被MVA-5-P激酶(PMK)催化生成甲羥戊酸-5-焦磷酸(MVA-PP)，最后在MVA-PP脫羧酶(DPMD)作用下發(fā)生脫羧并雙鍵化生成IPP。IPP/DMAPP異構(gòu)酶IDI 催化IPP的異構(gòu)生成DMAPP。該經(jīng)典MVA途徑中的酶系組成和各酶的功能研究已經(jīng)比較透徹。然而，最近的研究表明某些古生菌(Archaea)中可能存在異于該經(jīng)典MVA途徑的合成旁路[13-14]。在沃氏嗜鹽富饒菌(Haloferaxvolcanii)中，MVA-5-P可能先經(jīng)過MVA-5-P脫羧酶(PMD)脫羧作用生成異戊二烯磷酸(IP)，再經(jīng)過IP激酶(IPK)磷酸化生成IPP。在嗜酸熱原體菌(Thermoplasmaacidophilum)中，MVA的磷酸化由甲羥戊酸3-激酶(M3K)催化，在MVA的3′位羥基發(fā)生磷酸化，生成甲羥戊酸3-磷酸(MVA-3-P),繼續(xù)由甲羥戊酸-3-磷酸5-激酶(MVA-3-P 5-kinase)在其5′-OH位磷酸化生成甲羥戊酸-3,5-雙磷酸(MVA-3,5-BP),最后經(jīng)由MVA-5-P脫羧酶PMD和IP激酶催化生成IPP。

1.2 萜類化合物的枝端合成途徑

主干途徑顯示為棕黃色，枝端途徑顯示為灰色，可分為各類萜烯母核分子合成(淺綠色)和多種母核修飾途徑(淺藍(lán)色)兩層圖2 萜類化合物生物合成路線示意Fig.2 Scheme of biosynthesis routs of terpenoids

基本結(jié)構(gòu)單元DMAPP和IPP是所有萜類的共同前體。1分子DMAPP在相應(yīng)異戊二烯焦磷酸合成酶的催化作用下，聚合不同分子數(shù)量的IPP形成香葉基焦磷酸(GPP)、法尼基焦磷酸(FPP)和香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)等。接著，這些焦磷酸中間體再經(jīng)過不同的萜類合成酶(TPS)催化發(fā)生脫磷、環(huán)化和羥化反應(yīng),生成結(jié)構(gòu)各異的萜類烯烴(olefins)和烯烴醇(圖2)。依據(jù)所含C5基本結(jié)構(gòu)單元的數(shù)量，劃分為半萜烯(hemiterpenes,C5)、單萜烯(monoterpenes,C10)、倍半萜烯(sesquiterpenes,C15)和雙萜烯(diterpenes,C20)。另外，2分子FPP以頭對頭的方式經(jīng)鯊烯合成酶(SQS)催化合成鯊烯(C30)；也可以經(jīng)脫水鯊烯合成酶(DSQS)合成脫水鯊烯，再經(jīng)脫水鯊烯去飽和酶(DSQD)合成4,4′-四神經(jīng)孢子(4,4′-diaponeurosporene,C30)——C30類胡蘿卜素類(C30 carotenoids)化合物的前體。同樣，2分子GGPP以相同的方式經(jīng)八氫番茄紅素合成酶(PHS)催化合成八氫番茄紅素，再經(jīng)八氫番茄紅素去飽和酶(DSQD)生成番茄紅素(lycopene,C40)——C40類胡蘿卜素類化合物和維甲類物質(zhì)(retenoids，C20)的前體。以這些酶構(gòu)建萜類化合物的枝端合成途徑可以合成各類在結(jié)構(gòu)層面多樣的萜類化合物骨架母核(圖2)。進(jìn)而，這些母核分子還可以經(jīng)過羥基化、環(huán)氧化、糖基化和鹵化等多種修飾作用，形成種類更加豐富的、生物活性趨向更加多樣化的各類物質(zhì)。氧化是萜類化合物修飾中最常見的方式，多數(shù)情況下通過細(xì)胞色素P450氧化酶系(CYPs)進(jìn)行單加氧反應(yīng)[15]。例如，檸檬烯(limonene)由檸檬烯-6-羥化酶催化在6位發(fā)生催化生成香芹醇(carveol)；黃花蒿CYP71AV1能催化紫穗槐二烯(amorphadiene)到青蒿酸(artenisinic acid)的多步氧化；鯊烯能在鯊烯環(huán)氧酶(squanlene epoxidase)的催化下生成環(huán)氧鯊烯(2,3-oxidosqualene)。

2 大腸桿菌代謝工程合成萜類化合物

2.1 MEP通路的代謝工程

大腸桿菌利用其固有MEP途徑合成IPP和DMAPP 2種基本結(jié)構(gòu)單元。該內(nèi)源通路可能在轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后多個水平進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)控[16]，然而其調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。MEP通路的8個基因(包括idi)分散在基因組的7個不同座位。最普遍的調(diào)控策略是通過MEP通路限速酶(如Dxs、Dxr和Idi等)的過表達(dá)以提高前體物IPP和DMAPP的合成。例如，通過表達(dá)并優(yōu)化Dxs、Dxr和Idi這3個酶在載體上的表達(dá)順序，將異戊二烯絕對生產(chǎn)強度從0.47 mg/(g·h)(以1克細(xì)胞干質(zhì)量計)提高到2.73 mg/(g·h)[17]。將Dxs、Idi、IspD和IspF這4個酶模塊化，通過啟動子及拷貝數(shù)的改變調(diào)控MEP通路，同時結(jié)合調(diào)控紫杉二烯合成模塊的表達(dá)優(yōu)化，該紫杉醇前體物的產(chǎn)率近1.0 g/L[3]。與利用載體過表達(dá)限速酶相比，研究者們也嘗試了直接調(diào)控大腸桿菌內(nèi)源限速酶的表達(dá)。通過無痕編輯dxs和idi基因與啟動子間的核糖體結(jié)合區(qū)(RBS)，β-胡蘿卜素工程菌株產(chǎn)β-胡蘿卜素的產(chǎn)率提升了2.5倍，從1.53 mg/g提升到5.33 mg/g(以1 g細(xì)胞干質(zhì)量計)。進(jìn)一步加強β-胡蘿卜素模塊的表達(dá)，調(diào)節(jié)限速酶Dxr和Idi,強化表達(dá)水平,提升IPP和DMAPP合成前體的能力，最終β-胡蘿卜素產(chǎn)率達(dá)到18.4 mg/g[18]。

MEP通路利用糖酵解途徑中的G-3-P和丙酮酸為底物，并按1∶ 1的摩爾比起始合成，而2種底物在大腸桿菌代謝網(wǎng)絡(luò)中的濃度與此要求有較大差異。早期的研究表明，通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Ppc)或者合成酶(Pps)過表達(dá)使得代謝流從丙酮酸向G-3-P逆向，此策略平衡了MEP通路2個起始底物的比例，將工程菌產(chǎn)番茄紅素的量提高了3～5倍[19]。最近的研究將底物的來源途徑從糖酵解途徑轉(zhuǎn)換為Entner-Doudoroff(ED)途徑和戊糖磷酸(PPP)途徑，使得工程菌利用MEP途徑合成萜類的效率呈數(shù)倍提高[20-21]。

MEP通路的激活還需要輔因子ATP和NADPH的參與。合適的NADPH氧化還原狀態(tài)和濃度是維持Dxr、IspG和IspH活性，提高M(jìn)EP通路合成效率的重要保障。過表達(dá)黃素氧還蛋白(FldA)及其還原酶(Fpr)和NAD激酶使得工程菌通過MEP通路合成原伊魯烯(protoilludene)的產(chǎn)量提升6.6倍，從67.4 mg/L升至512.7 mg/L[22]。

MEP通路復(fù)雜，其調(diào)控體系尚不明晰，而代謝工程的改造需要精確地控制各酶組分的表達(dá)，以避免代謝中間產(chǎn)物(如MEcPP)的累積[23-24]。例如，通過平衡IspG和IspH的表達(dá)水平，MEcPP的累積得以消除，改造后的工程菌株合成β-胡蘿卜素和番茄紅素的能力提升了70%以上[25]。此外，研究者們嘗試以D-阿拉伯糖為碳源，利用果糖-6-磷酸醛縮酶對糖底物的廣譜活性來合成DXP，為MEP通路提供新的底物[26]。隨著對MEP通路調(diào)控理解的加深，通過此通路合成萜類化合物一定會獲得更大的進(jìn)步。

2.2 MVA通路的代謝工程

異源表達(dá)MVA通路是一條被廣泛接受的策略，通過促進(jìn)IPP和DMAPP的供給，從而在大腸桿菌中提升萜類產(chǎn)量。伯克利大學(xué)杰伊·凱斯林(Jay Keasling)研究組首先將此通路引入大腸桿菌中來提升青蒿素前體紫穗槐二烯(amorphadiene)的產(chǎn)量[27]，為很多研究組通過編輯此通路在大腸桿菌中合成多種萜類物質(zhì)提供了范例。通過RBS起始蛋白質(zhì)的翻譯強度，優(yōu)化MVA通路各組分的表達(dá)水平，使得紫穗槐二烯產(chǎn)量達(dá)到3.6 g/L的水平。還有以變更啟動子、載體拷貝數(shù)及同源基因替換的策略來調(diào)節(jié)MVA通路合成IPP和DMAPP，成功獲得多種萜類產(chǎn)物[28-30]。然而，MVA通路的過于上調(diào)或者萜類產(chǎn)物合成與IPP和DMAPP供給的失調(diào)，往往會造成IPP/DMAPP及其他焦磷酸中間產(chǎn)物的累積，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，影響到工程菌合成萜類產(chǎn)物的能力。與這些靜態(tài)調(diào)控策略相比，研究者們也發(fā)明出了一些巧妙的策略來動態(tài)調(diào)控MVA通路合成IPP和DMAPP[31]。例如，法尼基焦磷酸(FPP)應(yīng)答型啟動子可以敏銳地反饋細(xì)胞內(nèi)FPP的濃度水平，從而調(diào)節(jié)FPP的合成水平，并使之向紫穗槐二烯轉(zhuǎn)化，這使得產(chǎn)物的產(chǎn)量比靜態(tài)調(diào)控的產(chǎn)量翻番，搖瓶培養(yǎng)達(dá)到1.2 g/L的水平[32]；相同的策略使得工程菌產(chǎn)β-胡蘿卜素達(dá)到23 mg/g的水平[33]。通過群集效應(yīng)系統(tǒng)感知種群密度來控制整個合成通路的表達(dá)水平，促使工程菌能合成1.1 g/L紅沒藥烯[34]。

MVA通路的調(diào)節(jié)具有更強的魯棒性，雖然調(diào)控的精度較低，但是對底盤細(xì)胞的適應(yīng)性比MEP通路要強。通過補料分批培養(yǎng)，紅沒藥醇產(chǎn)量達(dá)到了9.1 g/L[35]；結(jié)合通氣回收，補料分批培養(yǎng)異戊二烯的產(chǎn)量可達(dá)到60 g/L[36]。

MVA通路的一些旁路途徑的發(fā)現(xiàn)可以豐富MVA通路的代謝改造策略，例如,IP中間產(chǎn)物可以直接用來脫磷生成異戊二烯醇，以縮短合成路線，提高合成效率[37]。從化學(xué)計量學(xué)的角度來看，利用MVA通路從碳源(如葡萄糖)合成IPP和DMAPP是1個多余的合成NADH還原力的過程，進(jìn)而表現(xiàn)出碳源利用的低經(jīng)濟(jì)性；而利用MEP通路進(jìn)行合成則是一個高經(jīng)濟(jì)性的過程，但需要額外的還原力，耦聯(lián)這2條通路，可達(dá)到碳源和能量的平衡態(tài)，補料分批發(fā)酵此工程菌株可產(chǎn)出24 g/L異戊二烯，產(chǎn)率達(dá)到0.267 g/g(以1 g葡萄糖質(zhì)量計)[38]。

2.3 枝端合成途徑的代謝工程

在優(yōu)化MEP和MVA途徑、建立IPP和DMAPP供給平臺的情況下,引入不同的枝端萜類合成通路就可實現(xiàn)目標(biāo)萜類產(chǎn)物在大腸桿菌中的合成。迄今為止，數(shù)以千計的植物、真菌或細(xì)菌來源的萜烯合成酶信息已收錄在數(shù)據(jù)庫中，這為大腸桿菌合成不同的萜類產(chǎn)物提供了可能。事實上，如前所述的許多案例也證明了這一點。萜類在自然界中作為次級代謝產(chǎn)物，產(chǎn)量極低，這可能是萜烯合成酶的催化活性(kcat)偏低，因而不能高效高產(chǎn)萜類化合物。萜烯合成酶盡管在蛋白質(zhì)序列上表現(xiàn)出很大的差異，但是它們都共享1個多α-螺旋骨架結(jié)構(gòu)和極度保守的催化結(jié)構(gòu)域，因此，研究者們得以理性設(shè)計和/或隨機(jī)進(jìn)化來編輯萜烯合成酶，提升其催化活性。例如，以理性設(shè)計法高通量篩選獲取的蒎烯(pinene)合成酶合成蒎烯的能力提升了1倍；對左旋海松二烯合成酶催化域進(jìn)行理性設(shè)計，其合成能力提升了10多倍[39]。

萜烯合成酶類除表現(xiàn)出專一產(chǎn)物的合成活性外，還有相當(dāng)一部分具有合成多種產(chǎn)物的廣譜活性。以此特性為藍(lán)本，萜烯合成酶可以按照需求進(jìn)行定制[40]，或通過改變其底物的供給來合成不同的產(chǎn)物[41]。各種萜基焦磷酸中間產(chǎn)物可經(jīng)脫磷直接合成萜基生物燃料，因為萜類的結(jié)構(gòu)重排沒有特殊要求。因此，很多研究組在挖掘現(xiàn)有磷酸酶對萜基焦磷酸脫磷新功能方面進(jìn)行了很多嘗試。大腸桿菌磷脂酸甘油磷酸酶PgpB和YbjG可對FPP進(jìn)行脫磷繼而合成法尼醇[42]。Nudix水解酶家族成員NudB、NudF對IPP和DMAPP表現(xiàn)出很強的水解脫磷活性[43-44]，利用NudB大腸桿菌工程菌株可在搖瓶培養(yǎng)條件下合成2.2 g/L異戊二烯醇[45]。

對萜烯母核進(jìn)行修飾合成更具生物活性的萜類產(chǎn)物方面有待更進(jìn)一步的研究。細(xì)胞色素P450和其還原酶伴侶分子相融合能提高P450對萜烯的加氧活性[46-47]，以克服大腸桿菌本身低下的加氧修飾能力及不利的合成環(huán)境。此外，多菌聯(lián)合培養(yǎng)過程(consortia process)整合各自的生產(chǎn)特性或許是一條值得嘗試的策略[48]。

2.4 大腸桿菌細(xì)胞底盤代謝工程

系統(tǒng)生物學(xué)研究使得在多重組學(xué)(omics)水平上解析宿主代謝網(wǎng)絡(luò)和外源通路相互應(yīng)答，進(jìn)而加深底盤代謝網(wǎng)絡(luò)理解，為最終提升萜類或其他化合物產(chǎn)量提供保障[49-51]。在大腸桿菌中合成親脂性萜類物質(zhì)，需要轉(zhuǎn)運到胞外或者存儲到細(xì)胞膜上。分子量小的二萜(≤C20)等可以通過兩相雙層培養(yǎng)的方式將合成產(chǎn)物原位萃取到胞外有機(jī)相[52]，其通過膜通道轉(zhuǎn)運蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運的途徑也取得進(jìn)展[53-54]；然而，三萜、四萜產(chǎn)物卻很難通過兩相雙層培養(yǎng)萃取到有機(jī)相中再透過細(xì)胞膜，對其通過轉(zhuǎn)運通道蛋白向外轉(zhuǎn)運也并不理想[55]。研究者試圖通過編輯細(xì)胞膜以拓展其存儲空間，例如通過細(xì)胞內(nèi)膜的拓展，β-胡蘿卜素的單細(xì)胞產(chǎn)量提高2.9倍[56]。大腸桿菌底盤細(xì)胞的代謝工程還有很多方面的工作值得人們繼續(xù)深入研究。

3 總結(jié)和展望

代謝工程的發(fā)展使微生物合成萜類產(chǎn)物成為可能，并展現(xiàn)出微生物細(xì)胞工廠合成此類物質(zhì)的巨大潛能和優(yōu)勢。通過各種創(chuàng)新性的策略，優(yōu)化主干通路和枝端通路，成功合成了一大批萜類物質(zhì)。但是與種類紛繁的萜類化合物相比，更多的合成工作亟待挖掘。從合成產(chǎn)能(titer、rate和yield)角度考慮，現(xiàn)有的工程菌株和策略與工業(yè)生產(chǎn)尚存有距離。在大腸桿菌微細(xì)胞工廠中大量合成萜類產(chǎn)物必然會打破細(xì)胞既有的代謝網(wǎng)絡(luò)，將來的研究可能集中在以下四方面：①萜類化合物合成途徑優(yōu)化，如，RBS調(diào)控、通路模塊化、同源酶替換等。②大腸桿菌細(xì)胞底盤改造。如，菌株進(jìn)化、系統(tǒng)生物學(xué)代謝網(wǎng)絡(luò)解析。③萜類產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運和存儲。如，膜通道轉(zhuǎn)運蛋白挖掘、膜容積拓展。④萜類母核修飾途徑。如，P450加氧酶編輯、多菌聯(lián)合培養(yǎng)過程等。除對主干和枝端通路進(jìn)行不斷優(yōu)化外，還需要借助于系統(tǒng)生物學(xué)，解析和打造優(yōu)質(zhì)的大腸桿菌合成底盤，建立改造高效的萜類產(chǎn)物轉(zhuǎn)運途徑和存儲空間，開發(fā)可行性高的母核分子修飾途徑。我們相信改造大腸桿菌這一研究最為透徹的模式生物必將開創(chuàng)出微生物細(xì)胞工廠新局面，為工業(yè)規(guī)?；铣捎杏幂祁愇镔|(zhì)奠定基礎(chǔ)。