胡斌權, 儲海盟, 師長宏

(1. 94895部隊衛(wèi)生隊, 漳州 363000； 2. 空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心, 西安 710032)

胰腺癌是一種發(fā)病隱匿, 治療效果及預后極差的惡性腫瘤, 5年生存率僅為9%[1]。手術根治性切除仍是至今唯一可能治愈胰腺癌的方法, 但胰腺癌早期診斷困難, 多數(shù)患者確診時已屬晚期[2]。傳統(tǒng)的放化療方案療效甚微，毒副作用大[3-5], 因此, 選擇更為有效安全的藥物是迫切需要解決的問題。

基于動物模型上的基礎實驗可為臨床優(yōu)化用藥方案提供理論支持。來自胰腺癌臨床手術標本的人源性異種移植(patient-derived xenograft，PDX)模型較好保持了原發(fā)瘤的異質性，建立反映患者自身特征的藥物評價系統(tǒng)，臨床預見性高，應用于胰腺癌藥物篩選具有獨特優(yōu)勢[6,7]。此外，二代基因測序技術(next-generation sequencing，NGS)的發(fā)展極大地推動了腫瘤精準靶向治療的進程，多項研究表明[8,9]，基于PDXNGS的藥物篩選模式(PDX-NGS-based drug screening)在識別新的腫瘤生物標志物、治療靶點及研究化療藥物的耐藥機制上獨具優(yōu)勢，在胰腺癌的個體化治療研究中具有廣闊的應用前景。

1 胰腺癌PDX模型建模及基本特征

胰腺癌PDX模型常見的移植方式為皮下移植，如將患者新鮮的腫瘤組織剪為3 mm3碎塊，混合適量的基質膠，利用穿刺針移植到裸小鼠背部皮下，命名為P1代；移植瘤生長至1 000 mm3時，異氟烷麻醉小鼠，手術獲取腫瘤組織，在另一只裸小鼠皮下進行傳代，命名為P2代，以此類推，傳代至P5代。此過程中應用組織病理學和基因分型的手段對各代移植瘤進行朔源性分析，確定出合格的實驗標本[10,11]。研究[11,12]證實,胰腺癌PDX模型中移植瘤在基因分型檢測、組織病理學和生物標志物表達方面均與原發(fā)瘤保持了較好的一致性，即使多次傳代擴增(5～8代內)，原發(fā)腫瘤的生物學信息及遺傳特征仍能夠被穩(wěn)定地保留，因而在預測臨床治療反應上優(yōu)勢顯著。該研究[11]中，胰腺癌PDX模型的成模率與患者年齡、性別、患病史及腫瘤分化程度等均無顯著相關性，發(fā)現(xiàn)其與原發(fā)腫瘤的大小和淋巴浸潤情況顯著相關。其中，相比裸小鼠，SCID小鼠移植成模率較高, 可能與其免疫缺陷程度更高有關[13]。常規(guī)移植使用的小鼠中，裸小鼠存在T細胞缺乏，SCID小鼠存在T、B細胞缺乏，NOD-SCID小鼠則是一種非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠, 存在T、B、自然殺傷(NK)細胞及補體缺陷，因移植小鼠的免疫篩選作用，使得原發(fā)腫瘤的某些異質性可能會在體內傳代中丟失，人們在分析PDX模型結果時, 應注意某些表型的缺失，可選擇免疫缺陷程度更高的小鼠來降低這種影響[14]。

傳統(tǒng)的PDX模型構建中所用標本多數(shù)來源于手術切除下的瘤體組織，然而胰腺癌患者確診時多屬晚期，并無手術指證，難以獲得術中標本用于移植，這嚴重影響了該類人群利用PDX模型進行藥物篩選的可行性。近期研究報道[15]，對于晚期轉移或無法手術切除的胰腺癌患者，可使用活檢標本構建PDX模型，標本可在超聲內鏡引導下通過細針穿刺(fine-needle aspirate, FNA)獲得。該研究中移植成功率為33%，由此建立的FNA-PDX模型亦能較好地保留了患者腫瘤和基質組織病理學結構，不僅增加了特定階段PDX模型的儲備及遺傳信息的提取，也使得該模型的適用人群更廣。胰腺癌進展快，復發(fā)率高，在接受化療或手術的胰腺癌患者中, 中位復發(fā)時間為1年，2年內80%的患者復發(fā)，可供治療的時間窗極短，因此，在疾病確診初期即開始建立FNA-PDX模型、行基因表型及治療學的研究以評估個體化治療及疾病復發(fā)時的替代方案就顯得尤為重要[16]。

2 PDX模型適用于胰腺癌個體化藥物篩選及耐藥性研究

胰腺癌PDX模型在基因表達和藥物反應性方面均與原發(fā)瘤保持相對一致，可代替特定患者進行藥物篩選，而不同腫瘤患者來源的PDX模型其生物學和遺傳學特性會有所不同，對藥物的反應性也會有所差別。這樣可為不同腫瘤患者篩選出優(yōu)化的個體化用藥方案，同時也可用于耐藥機制的研究[17,18]。

研究發(fā)現(xiàn)[7]，胰腺癌PDX模型和體外培養(yǎng)的原代腫瘤細胞對吉西他濱的敏感性是一致的，在兩者的耐藥組中均存在骨性關節(jié)炎相關基因MCF2L基因高表達的情況，表明了MCF2L基因在吉西他濱耐藥中起到重要作用。另有研究[17]報道胰腺癌PDX模型用于奧沙利鉑、吉西他濱和伊立替康三種藥物的療效及副作用評價。其中吉西他濱抑瘤效果最為顯著，伊立替康療效次之，但副作用最輕。針對實驗結果，推薦吉西他濱作為患者的首選化療藥物，而選擇伊立替康進行維持治療。然而, 在將PDX模型的藥物篩選結果用于指導臨床用藥時, 需要重點關注以下幾點： ①PDX模型在傳代過程中部分原始腫瘤異質性可能會丟失，特定細胞亞群的過度生長，鼠源化間質和免疫微環(huán)境無法完全模擬腫瘤在患者體內真實的生長及轉移情況； 這些可能造成實驗結果的臨床預見性降低； ②由于PDX模型代表了不同患者的狀況,在篩藥過程中化療藥物劑量、治療頻次需要個體化的策略, 通過預實驗進行調整； ③同時PDX模型治療前的分組、治療時機、治療周期，停藥后觀察時間等因素都會影響藥物的評價效果[19-21]。

3 基于PDX-NGS的藥物篩選有助于胰腺癌的靶向研究

靶向治療具有準確、高效，毒副反應少等優(yōu)勢，是近年來腫瘤治療領域研究的熱點[22]，主要是依靠腫瘤的基因分析從突變的基因中識別出可干預的靶點，以便確定治療選擇，然而目前胰腺癌的研究中可干預靶點十分有限[23]。PDX模型和NGS技術的成功整合為腫瘤的靶向治療和個體化治療研究提供了有效的手段[24]。該研究模式主要是通過NGS技術對癌癥患者或PDX模型上的腫瘤組織行高通量基因檢測分析，發(fā)現(xiàn)臨床療效肯定的靶點及可干預的潛在治療靶點，預測藥物療效及分析耐藥機制，然后利用PDX模型對基因分析后預測的敏感藥物進行療效評價，最終將藥物篩選結果用于指導患者臨床用藥選擇，從而提供精準的個體化治療方案。Guan等[8,9]發(fā)現(xiàn)，司美替尼(AZD6244)作為促分裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MEk1)的高度選擇性抑制劑在胰腺癌PDX模型上療效確切，提示MEk1可能成為胰腺癌潛在的治療靶點。基因測序發(fā)現(xiàn)該組胰腺癌PDX模型中腫瘤細胞的成纖維細胞生長因子受體1(FGFR1)基因擴增了3.1倍，略高于RECQL4、SOX2、MYC和PIK3CA等其余研究位點，隨后通過使用PDX模型對FGFR的抑制劑AZD4547進行療效評估，發(fā)現(xiàn)該抑制劑對PDX模型能起到顯著治療效果，提示其可能是治療FGFR 1過表達型胰腺癌患者的有效藥物，同時，也證實了基于PDX-NGS的藥物篩選在識別胰腺癌治療靶點和個體化藥物篩選中具有很高的應用價值。

4 PDX模型在靶向胰腺癌微環(huán)境研究中的應用

胰腺癌細胞具有高度異質性，靶向殺傷腫瘤細胞治療策略針對不同的個體存在較大差異，相比之下，其腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)異質性較小，靶向腫瘤微環(huán)境具有高效、廣譜等優(yōu)勢[25]。胰腺癌細胞的快速增殖可導致局部營養(yǎng)物質和氧氣的相對缺乏，從而產生以缺氧和高代謝壓力為特征的TME。缺氧的TME可誘發(fā)腫瘤血管生成、免疫抑制及其他大量信號通路的產生，促進癌癥的進展和轉移[26]。胰腺癌基膜聚糖(lumican)可抑制胰腺腫瘤細胞的生長，在Ⅰ～Ⅲ期的胰腺癌患者中，原發(fā)腫瘤基質中存在基膜聚糖的患者經過治療后的生存時間比原發(fā)腫瘤基質中無基膜聚糖的患者長3倍[27]。Li等[26]使用胰腺癌PDX模型探究缺氧對胰腺星形細胞表達和分泌基膜聚糖的影響，發(fā)現(xiàn)缺氧降低了基質中星形細胞基膜聚糖的表達，并闡明了部分基質中的基膜聚糖與腫瘤微環(huán)境分子間的相互作用及信號通路，為抗腫瘤治療提供新的理論依據(jù)。PDX模型較好地保留了患者腫瘤基質成分，代表了部分人類基質的性質，適合作為靶向基質微環(huán)境研究的動物模型，但值得注意的是，隨著傳代次數(shù)增加，鼠源性的基質會逐漸代替人源性基質，目前尚無法明確這些基質成分可保留多久[19]。

胰腺癌微環(huán)境中富含不同種類的參與固有免疫和適應性免疫的免疫細胞，在腫瘤細胞的誘導下多數(shù)具有殺傷腫瘤的效應性免疫細胞數(shù)量減少、功能喪失，這種顯著的免疫抑制狀態(tài)，影響了化療藥物抗腫瘤作用[25]。胰腺癌的免疫治療其核心是通過解除原有的免疫抑制, 重新增值活化并重啟免疫細胞殺傷腫瘤細胞的功能, 其中, T細胞功能的活化是至關重要。臨床試驗證實[28], T細胞嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor T cells,CAR T)對包括實體腫瘤在內的腫瘤治療具有良好的臨床療效。Jiang等[29]使用胰腺癌PDX模型對這種新型CAR T細胞進行臨床前療效評價，發(fā)現(xiàn)抗間皮素CAR T細胞能有效抑制模型中移植瘤的生長，提示相應臨床途徑可能成為胰腺癌患者一種新的治療方式。此外，腫瘤免疫檢查點也是潛在的免疫治療靶點。當細胞毒T細胞上的程序性死亡受體1分子(programmed death 1, PD-1)與腫瘤細胞表面的程序性死亡配體1(programmed death ligand 1, PD-L1)結合時，抑制T細胞激活，使得腫瘤細胞能逃脫免疫系統(tǒng)的殺傷，Cao等[30]研究表明，雙靶向配體利達霉素(dual-targeting ligand-based lidamycin)可抑制胰腺癌PDX模型上腫瘤生長的部分原因可能是其抑制了PD-L1/PD-1信號通路，再次驗證了腫瘤免疫檢查點抑制劑可能為治療胰腺癌潛在的新途徑。近期研究[31]表明，胰腺癌PDX模型中小鼠惡病質的程度與腫瘤負荷無關，而與局部或全身的腫瘤免疫反應密切相關，實驗通過篩選出與惡病質發(fā)生程度密切相關的細胞因子，為免疫治療提供潛在的靶點，同時也證明了PDX模型在免疫治療靶點篩選中的重要價值。近年來，人源化腫瘤模型(humanized patient-derived xenograft, Hu-PDX)已逐漸被用于開展實驗，研究證實人的造血干細胞在小鼠體內可以產生各種免疫細胞，相比常規(guī)的PDX模型，Hu-PDX模型在小鼠中重建了人體免疫微環(huán)境，因而更適用于腫瘤免疫反應方面的研究[32]。加強對腫瘤微環(huán)境的研究，通過針對腫瘤細胞以及靶向重塑腫瘤微環(huán)境的雙重治療策略，必將在治療上實現(xiàn)新的突破。

5 展望

胰腺癌惡性程度極高，預后極差，深入了解治療失敗的機制，獲取更加高效的治療方案是亟需解決的問題。人們嘗試建立胰腺癌人源性類器官(patient-derived organoids，PDOs)模型進一步提高藥物篩選效能，該模型是直接使用患者腫瘤組織來進行體外三維(3D)培養(yǎng)構建的多細胞團，較好地保留原發(fā)腫瘤組織的異質性及生物學特性。相比PDX模型，PDOs具有培養(yǎng)周期短、成本低、成功率高等優(yōu)勢，并且由于類器官既可來源于腫瘤組織，又可來源于正常成體組織，故能夠用于研發(fā)出特異性針對腫瘤細胞而對正常細胞損傷較小的藥物。該技術可與PDX模型優(yōu)勢互補，共同推動胰腺癌個體化研究的進程[33,34]。

雖然胰腺癌PDX模型能代表腫瘤細胞的異質性，表現(xiàn)出不同的基因型和表型特征，可替代特定患者進行個體化藥物篩選試驗[35]。然而，2016年Nature[36]以及N Engl J Med[37]均發(fā)文對包括PDX模型在內的精準醫(yī)學提出質疑，受適用人群、制模周期長、成本高、腫瘤異質性及耐藥性等影響，最終真正受益的患者僅占所有患者的1.5%[21]。為此，研究者們應清醒地認識到使用PDX模型指導臨床胰腺癌個體化治療獲益人群有限[23]。因此，在強調PDX模型個體化藥物篩選的同時，更應關注共性研究的重要性[21,38]，通過整合基因數(shù)據(jù)、生物標志物及藥物反應性等信息，以建立相關的疾病數(shù)據(jù)庫的形式來優(yōu)化指導胰腺癌患者個體化治療可能會是更合理的選擇[35]。

目前，基于NGS-PDX的研究模式為胰腺癌個體化藥物篩選提供了良好的實驗平臺，為潛在的靶點篩選提供更廣闊的視野。隨著基因測序技術的普及、大數(shù)據(jù)與生物信息等交叉學科的不斷發(fā)展，胰腺癌PDX生物庫必將日趨完善。