郭 磊, 朱海杭, 周步良

(1. 揚(yáng)州大學(xué), 江蘇 揚(yáng)州, 225000; 2. 南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225000;3. 江蘇省蘇北人民醫(yī)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225000)

研究[1]顯示，在結(jié)腸直腸癌的發(fā)生過程中，膽汁酸可能通過不同的途徑誘導(dǎo)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的增殖，而高濃度的次級膽汁酸則對腫瘤有促進(jìn)作用。腸道菌群數(shù)量變化在結(jié)腸直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮一定的作用，如結(jié)腸直腸癌患者大腸埃希菌、屎腸球菌和酵母菌數(shù)量明顯增加，雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量明顯減少。目前，腸道菌群參與結(jié)腸直腸癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚不明確，而有關(guān)膽汁酸、次膽汁酸代謝、腸道菌群以及G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5(TGR5)在結(jié)腸直腸癌中表達(dá)的研究也不多見[2]。本研究通過檢測結(jié)腸直腸癌患者的膽汁酸水平、腸道菌群的分布，探討膽汁酸代謝、次級膽汁酸代謝與腸道菌群在結(jié)腸直腸癌發(fā)病中的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月—2018年3月本院胃腸外科行手術(shù)治療的結(jié)腸直腸癌患者80例為結(jié)腸直腸癌組，男52例，女28例，平均年齡(56.40±16.50)歲。另選取正常體檢人群80例作為對照組，男50例，女30例，平均年齡(53.40±7.67)歲。2組患者抽取的血漿標(biāo)本均為乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝外周血血漿。收集結(jié)腸直腸癌根治術(shù)后的癌組織(經(jīng)病理證實(shí))和癌旁組織(肉眼觀察距癌組織2 cm)處的糞便。所有患者術(shù)前無放療、化療史，標(biāo)本提取后投入液氮中冷凍，存放在-80℃的低溫冰箱中保存。結(jié)腸直腸癌患者性別、年齡、病理分型、腫瘤細(xì)胞分化程度、腫瘤細(xì)胞浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和周圍淋巴血管侵犯等臨床病理資料完整。參照2010年第7版國際抗癌聯(lián)盟(UICC)/美國癌癥腫瘤聯(lián)合會(huì)(AJCC)的結(jié)腸直腸癌臨床病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，包括Ⅰa期結(jié)腸直腸癌6例, Ⅰb期14例, Ⅱa期24例, Ⅱb期14例, Ⅲa期18例, Ⅲb期4例。根據(jù)TNM病理診斷標(biāo)準(zhǔn)分為高分化4例，中分化60例，低分化16例。有8例結(jié)腸直腸癌患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.2 研究方法

抽取結(jié)腸直腸癌組患者和正常體檢人群的血液，利用生化儀酶促法檢驗(yàn)總膽汁酸及次級膽汁酸表達(dá)水平，并將其與正常體檢人群的血液總膽汁酸及次級膽汁酸表達(dá)水平進(jìn)行對比。收集癌組織黏膜、正常組織黏膜以及對應(yīng)部位的糞便，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對提取的糞便細(xì)菌DNA進(jìn)行檢測，并定量分析PCR產(chǎn)物特異性，待分析反應(yīng)結(jié)束之后，由PCR儀分析定量結(jié)果。對腸道菌群進(jìn)行分析，首先過濾并處理原始數(shù)據(jù)，得到優(yōu)化的序列; 而后對嵌合體序列加以取出，得到有效序列，然后再進(jìn)行數(shù)據(jù)的聚類分析。每一個(gè)聚類都是一個(gè)操作單元(OTU), 根據(jù)聚類統(tǒng)計(jì)結(jié)果加以樣本的多樣性指數(shù)分析，以及對檢測測序的深度進(jìn)行分析[3]。采用RDP classifier貝葉斯算法進(jìn)行聚類的代表序列的相似水平分析，將相似水平設(shè)置為97%, 并對每個(gè)樣本的群落組成進(jìn)行水平統(tǒng)計(jì)，然后比對數(shù)據(jù)庫Silva 119 16S rRNA database(https: //www. arb-silva. de/)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

結(jié)腸直腸癌組膽酸、熊去氧膽酸、甘氨熊去氧膽酸、鵝脫氧膽酸、甘氨膽酸、牛磺脫氧膽酸、石膽酸水平顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01), 見表1。與癌旁組織的糞便腸道菌群微生態(tài)相比，癌組織的腸道菌群微生態(tài)顯著改變(P<0.05)。見表2。

表1 結(jié)腸直腸癌組與對照組總膽汁酸、次級膽汁酸水平比較 nmol/mL

與對照組相比, *P<0.05，**P<0.01。

表2 結(jié)腸直腸癌癌組織與癌旁組織的腸道菌群微生態(tài)比較

腸道菌群以O(shè)TUs的相對豐度(每個(gè)OUT中序列數(shù)的相對百分含量)表示。與癌旁組織相比, *P<0.05。

3 討 論

結(jié)腸直腸癌的發(fā)展是多階段、多步驟的過程，受到多種因素的影響。人體胃腸道蘊(yùn)藏著一個(gè)巨大而豐富的腸道群落，這些腸道菌群對宿主的營養(yǎng)及黏膜免疫功能起著至關(guān)重要的作用[4-6]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，有證據(jù)[7]表明復(fù)雜的腸道微生物群落在腸道腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。最近對腸道菌群與結(jié)腸直腸癌的研究[8]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸直腸癌患者的癌組織腸黏膜和正常人的正常組織腸黏膜腸道菌群結(jié)構(gòu)存在很大差異。本研究提示，結(jié)腸直腸癌患者癌組織腸道菌失調(diào)的明顯特征是丁酸鹽產(chǎn)生菌顯著減少。丁酸鹽具有降低細(xì)胞 DNA 氧化損傷、誘導(dǎo)已經(jīng)出現(xiàn) DNA 損傷的細(xì)胞凋亡、阻斷腫瘤組織細(xì)胞生長、減弱致癌酶的作用等功能，可降低宿主腸壁的損傷，降低患腸炎和結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。

腸道炎癥是罹患結(jié)腸直腸癌的重要危險(xiǎn)因子。本研究中，結(jié)腸直腸癌患者未檢測到雙歧桿菌。本研究采用半定量PCR檢測，結(jié)果顯示結(jié)腸直腸癌患者膽酸、熊去氧膽酸、甘氨熊去氧膽酸、鵝脫氧膽酸、甘氨膽酸、牛磺脫氧膽酸、石膽酸水平較健康體檢人群顯著升高(P<0.05)。本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中，總膽汁酸和次級膽汁酸表達(dá)水平的異常、腸道菌群微生態(tài)的改變可能起著重要的作用。