賴(lài)明華 楊嵐淞

(云南省第一人民醫(yī)院 1乳腺甲狀腺外科，云南 昆明 650032；2消毒供應(yīng)中心)

乳腺癌在女性腫瘤中發(fā)病率居首位〔1〕。研究表明，多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)由多基因、多階段參與的復(fù)雜過(guò)程，目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)用于乳腺癌預(yù)防和治療的靶基因〔2〕。谷氨酰胺酶(GLS)1是谷氨酰胺-谷氨酸循環(huán)途徑中的限速酶，可通過(guò)分解谷氨酰胺而提供腫瘤細(xì)胞快速增殖所需的重要能量來(lái)源〔3〕。在結(jié)直腸癌、乳腺癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)GLS1基因的過(guò)度表達(dá)，GLS1表達(dá)影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，抑制其表達(dá)可降低結(jié)直腸癌的增殖活力〔4，5〕。有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中GLS1的表達(dá)與患者生存率有關(guān)〔6〕。本研究試圖證實(shí)GLS1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰蛋白酶、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Bibco；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)試劑購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙錠(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購(gòu)自碧云天公司；GLS1、p53、survivin、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷酸化的絲氨酸蘇氨酸激酶(p-AKT)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signal公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及GLS1的siRNA轉(zhuǎn)染 人MCF-7乳腺癌細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞在37℃，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中用RPMI1640培養(yǎng)液(含血清及青鏈霉素)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)為生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)參照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)，分別將合成的GLS1 siRNA及無(wú)干擾作用的siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，分別標(biāo)記為GLS1-siRNA組和陰性對(duì)照組，細(xì)胞中僅加入脂質(zhì)體的為空白對(duì)照組。收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞用于檢測(cè)GLS1表達(dá)。

1.3Western印跡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，細(xì)胞中加入適量的RIPA裂解液裂解細(xì)胞30 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，每泳道取等量上樣蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離，分離后轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%的脫脂奶粉封閉，4℃孵育一抗過(guò)夜，其中GLS1、p53、survivin、PI3K、p-AKT蛋白皆按1∶500稀釋?zhuān)瑑?nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)按照1∶1 000稀釋?zhuān)茨?次，室溫孵育二抗〔1∶10 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G〕1 h，洗膜，滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑曝光顯影。

1.4GLS1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響 采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力。GLS1-siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞24、48、72 h后，在每個(gè)細(xì)胞孔中加入MTT(5 mg/ml)溶液20 μl，常規(guī)培養(yǎng)于培養(yǎng)箱內(nèi)4 h，吸棄上清液，每孔加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩混勻10 min，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定每孔的吸光度值(A值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5GLS1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 各組細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用Annexin V-FITC/PI雙染法，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。收集GLS1-siRNA轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞3次，胰酶消化后將細(xì)胞密度調(diào)整為每毫升含1×106個(gè)細(xì)胞，結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記的Annexin V和PI各5 μl，避光室溫孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1GLS1-siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后GLS1的蛋白表達(dá) GLS1-siRNA組GLS1蛋白表達(dá)(0.168±0.021)顯著低于空白對(duì)照組(0.617±0.072，P<0.05)，陰性對(duì)照組(0.629±0.075)與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 GLS1-siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后GLS1的蛋白表達(dá)

2.2GLS1-siRNA轉(zhuǎn)染降低MCF-7細(xì)胞活力 GLS1-siRNA組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24、48和72 h后細(xì)胞活力均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 GLS1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響值，n=3)

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05；下表同

2.3GLS1-siRNA轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡 與空白對(duì)照組比較，GLS1-siRNA組細(xì)胞凋亡率顯著升高，survivin蛋白表達(dá)顯著降低，p53的蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 Western印跡檢測(cè)GLS1-siRNA轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞survivin和p53的蛋白表達(dá)

組別凋亡率(%)survivinp53空白對(duì)照組1.36±0.250.378±0.0450.134±0.015陰性對(duì)照組1.45±0.280.362±0.0410.121±0.013GLS1-siRNA組11.77±1.321)0.182±0.0231)0.347±0.0421)F/P值171.145/0.00025.173/0.00167.155/0.000

2.4GLS1-siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)MCF-7細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路 與空白對(duì)照組比較，GLS1-siRNA組PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表3。

圖3 GLS1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MCF-7細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

組別PI3Kp-AKT空白對(duì)照組0.334±0.0380.120±0.015陰性對(duì)照組0.356±0.0410.128±0.016GLS1-siRNA組0.153±0.0191)0.046±0.0081)F/P值32.037/0.00133.754/0.001

3 討 論

多種癌癥發(fā)病的分子機(jī)制涉及抑癌基因表達(dá)的下調(diào)和癌基因表達(dá)的上調(diào)。腫瘤的分子靶向治療已成為腫瘤治療熱點(diǎn)，大多數(shù)腫瘤的靶向治療是針對(duì)各種信號(hào)通路中的癌基因，然而，對(duì)腫瘤細(xì)胞代謝分子的調(diào)節(jié)也可能是一種潛在的治療靶點(diǎn)〔7，8〕。谷氨酰胺是在腫瘤細(xì)胞中消耗最多的一種氨基酸，其代謝可產(chǎn)生加快細(xì)胞增長(zhǎng)所需的原料〔9〕。GLS1在谷氨酰胺代謝中發(fā)揮重要作用，在人體腫瘤中表達(dá)廣泛，在多種腫瘤中發(fā)揮促腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)的作用〔10〕。有研究顯示，抑制膠質(zhì)瘤中GLS1基因表達(dá)可降低細(xì)胞的生長(zhǎng)〔11〕。

已有研究顯示乳腺癌中GLS1有高表達(dá)〔5〕。由于RNA干擾技術(shù)可在染色質(zhì)水平及轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，且有很強(qiáng)的序列特異性，在基因的腫瘤治療中也有廣泛的應(yīng)用〔12，13〕，本文提示GLS1可影響乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡。促凋亡基因和抑凋亡基因均可影響乳腺癌細(xì)胞的凋亡，p53是一個(gè)發(fā)現(xiàn)較早的癌癥相關(guān)抑癌基因，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在包含乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中均有研究〔14〕。survivin具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促增殖和抗凋亡的功能，在多種腫瘤中表達(dá)升高，survivin可作為乳腺癌預(yù)后判斷指標(biāo)，抑制乳腺癌中survivin的表達(dá)可降低細(xì)胞增殖及促凋亡〔15，16〕。本文結(jié)果提示GLS1可通過(guò)調(diào)節(jié)p53和survivin的表達(dá)影響乳腺癌細(xì)胞的凋亡。PI3K/AKT信號(hào)通路在多種人類(lèi)腫瘤表達(dá)失調(diào)，如乳腺癌、卵巢癌等，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔17，18〕。乳腺癌中PI3K/AKT信號(hào)通路的活化率較高，抑制該通路可降低乳腺癌的增殖及誘導(dǎo)凋亡〔19〕。本文結(jié)果提示GLS1可通過(guò)下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上，通過(guò)RNA干擾抑制GLS1基因在乳腺癌中的表達(dá)可降低癌細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路，其中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式是下調(diào)survivin表達(dá)和上調(diào)p53表達(dá)。GLS1基因可能成為乳腺癌治療有價(jià)值的工具。