鄭紅 趙宏斌 袁鑫 吳超 角建林 唐薇

(昆明醫(yī)科大學(xué) 1實驗動物學(xué)部，云南 昆明 650500；2第一附屬醫(yī)院；3技術(shù)轉(zhuǎn)移中心)

骨質(zhì)疏松(OP)是一種全身代謝性骨骼疾病，其特征是骨量減少、骨骼微觀結(jié)構(gòu)退化，最終導(dǎo)致骨脆性增加，使患者易于發(fā)生骨折〔1,2〕。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP) 是由于女性絕經(jīng)以后機體雌激素水平下降而引發(fā)的〔3〕，是OP中最重要的一種形式，病人年齡通常界定在50～70 歲。PMOP在中醫(yī)上屬 “骨痿、骨痹”的范疇，而腎虛是其根本原因。中醫(yī)理論認(rèn)為腎藏精，主骨生髓〔4〕，因此，骨骼的生長、發(fā)育及修復(fù)等功能均依賴于腎中精氣的蓄存和滋生。源自云南彝藥的恒古骨傷愈合劑(OK)，是我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的民族藥物。OK主要由三七、紅花、陳皮、杜仲等中草藥配制而成，具有滋陰益腎、補腎溫陽、補脾益氣、氣血雙補等功效，符合中藥治療PMOP的藥理學(xué)需求〔5,6〕。在本次研究中，筆者將最接近靈長類的實驗動物樹鼩去除卵巢創(chuàng)建PMOP模型，評價OK的促骨形成作用及對PMOP的治療效果，特別是其對在成骨細(xì)胞增殖和分化過程中起重要作用的信號通路磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/糖原合成酶(GSK)-3β所起的調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1實驗動物 60只12月齡雌性滇西亞種樹鼩，體重100～120 g，昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滇)K2013-0002，使用許可證號：SYXK(滇)K2015-0002。所有樹鼩單籠飼養(yǎng)，實驗室溫度 20～25℃，濕度控制在20%～30%，自由攝食、飲水，實驗動物基礎(chǔ)顆粒飼料和水果混合飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w后用于實驗。

1.2實驗藥品及主要試劑 OK(由三七、黃芪、人參、紅花、杜仲、鱉甲、陳皮等配方制成,每毫升中生藥含量為 0.36 g)由云南克雷斯天然藥物制藥廠生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：Z20025103；結(jié)合雌激素片(新疆新姿源生物制藥有限責(zé)任公司，批號20130802)；雌二醇(E2)、骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(OC)和I型原膠原N-端前肽(PINP)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RNA總提取試劑盒(北京Tiangen公司)；第一鏈逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)；引物基因合成(美國Invitrogen公司)；熒光PCR染料混合液(瑞士Roche公司)；PI3K、AKT、GSK-3β和 β-actin一抗(美國Cell Signal Technology公司)；相應(yīng)辣根酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋公司)；電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒(美國Millipore公司)。

1.3主要儀器和設(shè)備 紫外分光光度計及電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；瑞士羅氏cobas c 311全自動生化分析儀；全波段酶標(biāo)儀(Thermo fisher公司)；低溫離心機(德國Eppendorf公司)；垂直電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；7300實時熒光定量 PCR儀(美國 ABI公司)；Prodigy-BX IL雙能X線(DXA)骨密度(BMD)測量儀(美國Lunar公司)。

1.4分組及給藥 60只實驗樹鼩中隨機選取10只作為正常組(不做任何處理)，剩余50只去除兩側(cè)卵巢(樹鼩全身BMD檢測下降25%)作為PMOP模型動物，再隨機分為模型組(每天生理鹽水灌胃)，OK低、中、高劑量組(分別給予OK 0.5、1.5和3.0 ml/d灌胃治療)，陽性藥對照組給予1.5 ml/d 結(jié)合雌激素灌胃治療)，每組10只。10 w后處死樹鼩。

1.5BMD檢測 各組樹鼩腹腔注射水合氯醛麻醉，俯臥位固定于DXA BMD測定儀實驗臺上，拉直脊柱后行DXA測定BMD。

1.6標(biāo)本收集 實驗樹鼩處死前禁食不禁水12 h，稱量并記錄體重后，腹腔注射3.6%水合氯醛(1 ml/100 g)，心臟采血，室溫放置1～2 h后，3 500 r/min離心10 min，收集血清，取右側(cè)下肢鈍性分離，剝離干凈皮膚和肌肉組織，生理鹽水洗凈骨頭后，置于液氮中速凍，取出溶解，如此重復(fù)3次后，研磨成粉漿狀存于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7血生化相關(guān)指標(biāo)檢測 各組樹鼩取血清，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒測定E2、BALP和OC、PINP的含量，具體步驟按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.8RT-qPCR檢測相關(guān)指標(biāo)mRNA表達(dá)水平 取各組樹鼩右下肢骨組織，經(jīng)液氮速凍和反復(fù)研磨好的骨組織約100 mg超聲粉碎，Trizol提取總RNA，定量后反轉(zhuǎn)錄為隨機 cDNA，加入引物及熒光染料進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸35 s，循環(huán)40次，72℃最后再延伸5 min。結(jié)果采用RT-qPCR 相對擴(kuò)增分析法 2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計分析，每組實驗至少重復(fù)3次。引物設(shè)計見表1。

表1 引物設(shè)計序列

1.9Western印跡檢測相關(guān)指標(biāo)蛋白表達(dá)水平 取出研磨好的骨組織約1 g，加入RIPA組織裂解液和蛋白酶抑制劑(PMSF)勻漿，蛋白定量后沸水浴約15 min，每個樣品取50 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗4℃過夜，二抗孵育2 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑 ECL顯色，曝光，以β-actin作為內(nèi)參，掃描圖像，用Image J軟件計算各條帶的吸光度值，每組實驗至少重復(fù)3次。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件，兩組間計量資料比較采用t檢驗，多組計量資料比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1OK對各組體重和E2的影響 與正常組比較，模型組體重明顯變高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而藥物灌胃治療后體重略有下降，但與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與正常組比較，模型組E2含量下降明顯，經(jīng)OK灌胃治療后，E2含量逐漸升高，表現(xiàn)出劑量依賴性，且與模型組相比，OK中劑量與高劑量組治療效果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.2OK對BMD的影響 與正常組〔(0.23±0.02)g/cm2〕相比，模型組BMD〔(0.13±0.01)g/cm2〕降低明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，治療10 w后，各治療組BMD逐漸增加〔OK低、中、高劑量組分別為(0.14±0.01)、(0.18±0.01)、(0.22±0.02)g/cm2〕，且隨OK劑量增加，治療效果更加明顯；此外，陽性藥對照組BMD〔(0.18±0.02)g/cm2〕也升高明顯，與OK中劑量組效果相當(dāng)。

表2 各組體重及E2含量、成骨標(biāo)志物對比

與正常組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；下表同

2.3OK對各組成骨因子的影響 模型組血清BALP、OC和PINP的含量相較于正常組明顯降低(P<0.05)，表明去除卵巢誘導(dǎo)的PMOP樹鼩模型建立成功。經(jīng)過OK灌胃治療后，各治療組血清BALP、OC和PINP含量都有所增加，呈現(xiàn)出劑量依賴性，特別是OK中、高劑量組治療效果均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥對照組血清BALP、OC和PINP的含量也有所增加(P<0.05)，療效與OK中劑量相仿，見表2。

2.4OK對PI3K/AKT/GSK-3β信號通路mRNA的影響 模型組PI3K mRNA表達(dá)水平(2-ΔΔct值)比正常組明顯降低(P<0.05)，GSK-3β mRNA表達(dá)水平比正常組明顯升高(P<0.05)。經(jīng)過OK灌胃治療后，各治療組PI3K mRNA表達(dá)水平明顯升高，GSK-3β mRNA表達(dá)水平明顯降低，且效果都呈現(xiàn)出劑量依賴性，特別是OK中、高劑量組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥對照組PI3K mRNA表達(dá)水平也增加(P<0.05)，GSK-3β mRNA表達(dá)水平也明顯降低，療效與OK中劑量相仿；而各組AKT mRNA表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)，見表3。

2.5OK對PI3K/AKT/GSK-3β信號通路蛋白因子的影響 與mRNA檢測結(jié)果一致，模型組PI3K蛋白表達(dá)水平比正常組明顯降低(P<0.05)，GSK-3β蛋白表達(dá)水平比正常組明顯升高(P<0.05)。OK灌胃治療后，各治療組PI3K蛋白表達(dá)水平明顯升高，GSK-3β蛋白表達(dá)水平明顯降低，且效果都呈現(xiàn)出劑量依賴性，特別是OK中、高劑量組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥對照組PI3K蛋白表達(dá)水平也增加(P<0.05)，GSK-3β蛋白表達(dá)水平也明顯降低，療效與OK中劑量相仿。各組總AKT蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化(P>0.05)，但AKT的磷酸化(308位點)〔p-AKT cThr 308)〕水平變化明顯，在模型組中AKT的磷酸化水平明顯降低(P<0.05)，而OK灌胃治療后AKT磷酸化水平逐漸升高，呈現(xiàn)出劑量依賴性，與模型組相比，OK中劑量和高劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3，見圖1。

表3 各組PI3K、AKT和GSK-3β mRNA和蛋白水平對比

圖1 各組PI3K、AKT和GSK-3β蛋白表達(dá)比較

3 討 論

腎氣虛損和“骨枯” 密切相關(guān)，也就是說腎虛是OP的根本病因〔7〕。原發(fā)性O(shè)P主要發(fā)生在絕經(jīng)后婦女和老年人群中，主要表現(xiàn)為四肢酸軟、腰背疼痛、駝背及易于骨折等。臨床中常用雙膦酸鹽類、降鈣素類及雌激素類藥物治療PMOP，這些藥物主要作用都是抑制骨吸收〔8〕，而促骨形成的藥物相對較少，因此，尋找安全高效經(jīng)濟(jì)的骨形成促進(jìn)劑是臨床的迫切需求。應(yīng)用中藥促骨形成治療PMOP適合中國國情，具有較廣闊的應(yīng)用前景。來自我國云南彝族的民族特色藥物OK 由三七、紅花、陳皮、杜仲等配方制成，為治療骨折、骨病等的內(nèi)服方藥。本實驗結(jié)果顯示，OK具有優(yōu)良的促骨形成作用。

OK能夠通過促骨形成的作用緩解PMOP，但這種成骨作用是否通過促進(jìn)細(xì)胞增殖的方式目前不得而知，因此，本文也對此進(jìn)行了研究。包括 PI3K/AKT/GSK-3β和Wnt/β-catenin等在內(nèi)的多條細(xì)胞信號通路調(diào)控著細(xì)胞的增殖分化，特別是PI3K/AKT/GSK3β信號通路長期以來都是研究細(xì)胞增殖和抗凋亡信號領(lǐng)域的熱點〔9〕。作為PI3K下游的直接靶點蛋白,PI3K一旦激活后，可以使磷肌醇類因子發(fā)生磷酸化，從而發(fā)揮生物活性，特別是PI3K能夠磷酸化AKT的第308位酪氨酸從而激活A(yù)KT,因此其是該蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)樞紐〔10〕。GSK-3β是其下游因子，是體內(nèi)第一個被發(fā)現(xiàn)的AKT作用底物,AKT可使GSK-3β第9位絲氨酸磷酸化,降低GSK-3β的磷酸化水平從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；GSK-3β 作為 PI3K /AKT 通路下游重要的位點，主要作用是調(diào)控糖原的合成與代謝，除此之外其在調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的過程中也發(fā)揮了廣泛的作用。GSK-3β 也是Wnt/β-catenin 信號途徑的關(guān)鍵因子，可以磷酸化 β-catenin 的絲氨酸/蘇氨酸殘基，進(jìn)而促進(jìn) β-catenin 被泛素化降解，調(diào)控骨細(xì)胞的增殖〔11,12〕。本實驗發(fā)現(xiàn)，OK能夠上調(diào)PI3K的表達(dá)水平和AKT的磷酸化水平，并且下調(diào)GSK-3β的表達(dá)水平，這與實驗初期的假設(shè)是一致的，說明OK可以通過促進(jìn)骨細(xì)胞增殖的作用緩解PMOP，并且這種治療作用可能是通過調(diào)控PI3K/AKT/GSK-3β信號通路實現(xiàn)的，但其具體分子機制還需進(jìn)一步研究。