劉志廣 韓江紅 李寧

(1新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院胸瘤一科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院；3河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科)

肺癌是常見的高發(fā)病率和死亡率的惡性腫瘤，雖然通過大量研究，肺癌的診斷、治療有了一定的進(jìn)展，但其療效仍不盡人意〔1〕。腫瘤的形成和惡性轉(zhuǎn)化與癌基因的激活、抑癌基因的失活等密切相關(guān)。Six1(Sine oculis homeobox homolog1)定位于人14q23染色體，是新近發(fā)現(xiàn)的一個同源盒基因，在多種物種間表現(xiàn)出高度保守性，參與耳、眼、肌肉和神經(jīng)系統(tǒng)等組織器官的發(fā)育，可通過調(diào)節(jié)下游多種基因的表達(dá)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔2〕。目前在結(jié)直腸癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)Six1高表達(dá)，Six1的高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移等〔3～5〕。這些研究提示Six1可能是一種癌基因。然而，Six1對肺癌生物學(xué)特性的影響還未明確。本研究檢測了肺癌組織中Six1的表達(dá)情況，并通過小干擾RNA抑制Six1的表達(dá)，觀察細(xì)胞的增殖凋亡情況，進(jìn)一步研究誘導(dǎo)細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1組織樣本 收集新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院2014年6月至2016年3月胸外科手術(shù)切除的肺癌及相應(yīng)的癌旁組織(距離腫瘤邊緣1～3 cm)標(biāo)本各62例。肺癌均經(jīng)過病理學(xué)檢查證實，且術(shù)前均未行放化療。病理類型均為腺癌。其中男42例，女20例，中位年齡59歲。組織標(biāo)本手術(shù)切除后置于液氮罐中保存?zhèn)溆?。所有?biāo)本的采集均經(jīng)過患者及家屬的知情同意。

1.2細(xì)胞及試劑和儀器 人肺癌A549細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫;胎牛血清、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑盒、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，購自美國Sigma；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、CCK8試劑盒均購自中國碧云天試劑公司；膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒、流式細(xì)胞儀，購自美國BD公司；Six1、細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Notch1和Hes1抗體，購自美國abcam公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio Tek公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國PE公司。

1.3Six1基因在肺癌組織表達(dá) 組織蛋白提取試劑盒提取肺癌及癌旁組織中的總RNA，按照BCA試劑盒操作說明測定總蛋白濃度，30 μg的上樣蛋白，加入所需的5倍蛋白上樣緩沖液，混合均勻后100℃變性8 min，立即置于4℃冷卻，12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳跑膠(濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓100 V)，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Six1(1∶500稀釋)和內(nèi)參GAPDH(1∶1 000稀釋)抗體，4℃搖床緩慢搖動過夜，洗膜，加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG，洗膜。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒檢測，實驗重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞用含有10%胎牛血清及青鏈霉素雙抗的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2條件下傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明進(jìn)行操作。細(xì)胞分為空白組、陰性對照(NC)組和 Six1-siRNA組?？瞻捉M細(xì)胞中加入脂質(zhì)體，NC組和 Six1-siRNA組分別加入合成的無義siRNA序列和 Six1的靶向siRNA序列。轉(zhuǎn)染前1 d，以3×104/ml細(xì)胞密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長融合度約80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，Western印跡檢測各組細(xì)胞Six1蛋白表達(dá)。

1.5CCK8法檢測Six1-siRNA轉(zhuǎn)染對肺癌細(xì)胞增殖的影響 取生長至對數(shù)期的各組細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，每孔100 μl(含5×104個細(xì)胞)接種至96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)，分別于24 h、48 h和72 h在每孔細(xì)胞中加入CCK8溶液，視細(xì)胞生長狀況和顏色變化繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測波長為570 nm時的光密度(OD)，記錄結(jié)果，實驗重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測Six1-siRNA轉(zhuǎn)染對肺癌細(xì)胞凋亡的影響 以每孔1×105個細(xì)胞將各組A549細(xì)胞接種至6孔板，每孔添加2 ml，常規(guī)培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化細(xì)胞，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，收集細(xì)胞沉淀，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl的Annexin V-FITC，混合均勻后室溫避光反應(yīng)10 min，再加入5 μl的PI，室溫避光孵育5 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.7PCNA、Bax、Notch1和Hes1蛋白表達(dá)檢測 收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中的蛋白，按照1.3方法檢測各組細(xì)胞中PCNA、Bax、Notch1和Hes1的蛋白相對表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件，計量資料多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Six1在肺癌組織的表達(dá) Six1在癌旁組織及肺癌組織中的蛋白表達(dá)分別為(0.102±0.010)、(0.511±0.047)，肺癌組織中Six1的表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)。見圖1。

圖1 Six1在肺癌組織及癌旁組織的表達(dá)

2.2轉(zhuǎn)染Six1-siRNA的A549細(xì)胞Six1的表達(dá) 空白組、NC組和Six1-siRNA組Six1的蛋白表達(dá)分別為(0.383±0.036)、(0.381±0.035)、(0.177±0.015)，NC組Six1的蛋白表達(dá)與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而Six1-siRNA組Six1的蛋白表達(dá)顯著低于空白組(P<0.05)。見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染Six1-siRNA的肺癌細(xì)胞Six1的表達(dá)

2.3轉(zhuǎn)染Six1-siRNA對A549細(xì)胞增殖凋亡的影響 與空白組比較，Six1-siRNA組細(xì)胞24～72 h的細(xì)胞增殖均顯著降低(P<0.05)，在48 h的細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.4轉(zhuǎn)染Six1-siRNA對A549細(xì)胞PCNA、Bax、Notch1和Hes1蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，Six1-siRNA組PCNA、Notch1和Hes1的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表1，圖3。

表1 轉(zhuǎn)染Six1-siRNA后A549細(xì)胞增殖、凋亡率及PCNA、Bax、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)量比較

與空白組比較:1)P<0.05

圖3 轉(zhuǎn)染Six1-siRNA對A549細(xì)胞PCNA、ax、Notch1和Hes1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

Six1是Six蛋白家族成員，在成人組織中含量較低，過量表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生〔6〕。目前已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中出現(xiàn)Six1的過表達(dá)。Six1的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞向上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化〔7,8〕，這提示在多種腫瘤中Six1可能以腫瘤蛋白的作用存在。為了檢測肺癌中Six1的作用，本文首先檢測了肺癌組織中Six1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肺癌組織中也存在Six1的高表達(dá)，這說明Six1可能影響肺癌的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中Six1的高表達(dá)可增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖能力〔9〕；上調(diào)宮頸癌中Six1的表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，且使G2/M期縮短，而下調(diào)其表達(dá)后癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力均明顯降低〔10〕；下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞Six1的表達(dá)可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力〔11〕。以上研究提示抑制Six1的表達(dá)可降低腫瘤的發(fā)生發(fā)展。RNA干擾能特異、高效地抑制目的基因表達(dá)，是目前研究基因功能的新方法，已得到廣泛的應(yīng)用〔12〕。本研究中將Six1的siRNA轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞，通過CCK8法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞增殖及凋亡情況，發(fā)現(xiàn)Six1的表達(dá)受到抑制后，肺癌細(xì)胞的增殖明顯降低、凋亡率增加。這提示Six1在肺癌中也是癌基因。

肺癌的發(fā)生涉及多種癌基因和抑癌基因。PCNA是DNA合成不可缺少的因子，在細(xì)胞增殖過程中起重要作用，可作為評價惡性腫瘤增殖的良好指標(biāo)〔13〕，目前也應(yīng)用于肺癌增殖的檢測〔14〕。Bax為Bcl-2家族成員之一，發(fā)揮促凋亡作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)〔15〕。肺癌中Bax表達(dá)上調(diào)可引起癌細(xì)胞凋亡〔16〕。本研究抑制Six1的表達(dá)后檢測PCNA、Bax的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PCNA表達(dá)受到抑制、Bax表達(dá)上調(diào)，這說明Six1對肺癌細(xì)胞增殖凋亡的影響可通過調(diào)節(jié)PCNA、Bax的表達(dá)而實現(xiàn)。在多種腫瘤中Notch1信號通路過度表達(dá)，如肺癌、結(jié)直腸癌等，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔17,18〕。有研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)肺癌中Notch1信號可降低肺癌的增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔19〕。本研究為了證實Six1對肺癌增殖凋亡的影響是否通過影響Notch1信號通路，通過Western印跡檢測Notch1信號通路Notch1及下游靶基因Hes1的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Notch1和Hes1的表達(dá)均明顯降低。

綜上所述，抑制肺癌細(xì)胞Six1的表達(dá)后可降低癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；下調(diào)Notch1信號通路、抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的方式是下調(diào)PCNA表達(dá)和上調(diào)Bax表達(dá)。