唐芳 馬武開 盧向陽 肖麗娜 周靜 徐暉

(貴陽中醫(yī)學院 1第二附屬醫(yī)院風濕免疫科，貴州 貴陽 550001；2研究生院)

膝骨關節(jié)炎(KOA)是一種以膝關節(jié)軟骨退行性改變?yōu)橹鞯穆约膊?，主要由關節(jié)軟骨、滑膜及關節(jié)周圍肌肉損傷和骨質增生為特征，臨床主要表現(xiàn)為膝關節(jié)疼痛、腫脹、活動受限，該病發(fā)病機制尚不清楚，多數(shù)研究表明其與年齡、性別和體重等密切相關〔1，2〕。目前臨床上對KOA的治療方法，主要以改善關節(jié)癥狀，延緩關節(jié)退變程度為主，嚴重者采取膝關節(jié)置換術。中藥塌漬療法作為我國傳統(tǒng)的中醫(yī)外治方法，早已廣泛應用于臨床，且已被證實治療KOA有效〔3，4〕。最新研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路與KOA發(fā)病密切相關，其下游基因的表達水平與KOA關節(jié)軟骨退變程度有直接相關性〔5〕。據(jù)此我們在前期臨床和實驗研究的基礎上進一步驗證中藥塌漬療法治療KOA是否與其影響Wnt/β-catenin信號通路下游基因表達水平相關。為驗證該假說，我們通過建立兔KOA模型，探討不同溫度的中藥塌漬療法對KOA模型兔關節(jié)軟骨基質金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-13、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2、cylinD1、c-myc表達水平的影響。

1 材料及方法

1.1實驗動物及條件 健康新西蘭兔72只，雌雄各半(分籠飼養(yǎng))，體重(2.05±0.51)kg，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(黔)2012-0001。喂養(yǎng)飼料來源：貴州省農業(yè)科學院。實驗兔均進行1 w的適應期喂養(yǎng)，然后開始實驗。

1.2試劑及藥品 TRIzol總RNA提取試劑(天根生化科技有限公司，批號：DP405-02)、50 bp DNA Laddder(Solarbio，貨號：M1800)、PrimeScriptTMRT試驗盒(TaKaRa，批號：RR047B)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)，ROX plus(TaKaRa，批號：RR82LR)、DL2000 DNA Marker(TaKaRa，批號：3427Q)、雙氯芬酸二乙胺乳膠劑(扶他林，北京諾華制藥有限公司，國藥準字號：H19990291)、中藥溻漬療法中藥(活血通痹湯：方由透骨香、黑骨藤、海桐皮、透骨草、川芎、防風、白芷、乳香、沒藥、紅花、當歸、大血藤等藥組成)，由貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院中藥房提供。

1.3儀器 渦旋振蕩儀(QL-902，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、離心機 (Centrifuge 5415D，Eppendorf)、熒光定量PCR儀(ABI7500，Applied Biosystems)、分光光度計(NANODROP 2000，Thermo scientific)、凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 1600，上海天能科技有限公司)、-80℃冰箱(DW-HL388、中科美菱)。

1.4動物模型制作 采用隨機數(shù)字表法將新西蘭兔隨機分為6組，每組12只，分別為空白組、模型組、扶他林組、42℃中藥塌漬治療組、37℃中藥塌漬治療組、32℃中藥塌漬治療組。適應期喂養(yǎng)結束后，采用石膏管型固定法〔6〕用管型石膏和小鋁板將兔膝關節(jié)固定在伸直位，限制膝關節(jié)活動，制作兔KOA模型，造模時間為4 w。第5周起3個中藥塌漬組(42℃、37℃、32℃)將提前準備好的中藥用恒溫鍋維持相應的溫度恒定不變，將紗布裁剪合適大小后放入中藥中浸泡后擰至藥液不滴出，敷于兔造模膝關節(jié)上，每5 min更換1次紗布以維持塌漬溫度，每次塌漬20 min，每天1次；扶他林組是每次擠出約20 mg扶他林軟膏均勻涂擦于造模膝關節(jié)，并輕輕揉搓2～4 min；空白組和模型組正常飼養(yǎng)，給藥時間4 w。

1.5關節(jié)軟骨病理觀察 外治干預治療4 w后采取空氣栓塞法處死動物，先解剖造模膝關節(jié)，肉眼大體觀察關節(jié)軟骨表面，然后取各組兔膝關節(jié)軟骨制作標本。經中性甲醛固定，硝酸脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，由專人觀察各組標本病理。軟骨病理改變參考Mankin進行評分〔7〕。

1.6RT-PCR法檢測MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表達水平 引物由北京Invitrogen公司合成，見表1。

表1 目的基因引物序列

將軟骨組織盡量剪碎充分裂解后，采用Trizol提取細胞總RNA，具體按TRIzol總RNA提取試劑說明書進行。提取的RNA使用NanoDrop?ND-2000測定濃度和純度，cDNA產物在20 μl體系中進行，設定反應條件，取10 μl PCR擴增產物，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，自動凝膠成像分析儀分析。用Bandscan4.0軟件進行灰度掃描。用總灰度表示各條帶mRNA表達量，比較各泳道目的條帶與相應內參的灰度比，作為各目的條帶mRNA的相對含量。取3次獨立電泳的灰度比，計算平均值。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析及非參數(shù)檢驗。

2 結 果

2.1關節(jié)表面大體觀察 空白組可見關節(jié)表面光滑，有光澤富有彈性，未見裂痕，關節(jié)未見明顯腫脹、增生和滑膜充血；模型組可見關節(jié)面粗糙不平整，色澤暗淡，軟骨較薄伴有糜爛，關節(jié)明顯腫脹和明顯增生、滑膜充血；治療組關節(jié)表面情況均好于模型組但差于空白組，治療組組內比較，42℃中藥塌漬組關節(jié)表面較光滑，輕度關節(jié)腫脹和滑膜充血，較其他治療組稍好，而37℃中藥塌漬組、扶他林組、32℃中藥塌漬組均可見關節(jié)表面不平整，伴有關節(jié)腫脹和滑膜充血，肉眼觀察差異性不明顯。

2.2病理結果

2.2.1病理圖片 光鏡下可見空白組軟骨表面光滑，軟骨細胞數(shù)量較多，分布均勻，排列整齊，潮線完整；模型組軟骨較薄，表面粗糙，伴有列缺，細胞數(shù)目較少，排列紊亂，局部聚集明顯，染色不明顯，潮線模糊；治療組在軟骨表面光滑程度、細胞數(shù)目、分布、染色情況及潮線均好于模型組差于空白組，治療組組內比較，42℃中藥塌漬組鏡下軟骨表面較光滑，細胞數(shù)目較多，分布較均勻，可染色，潮線模糊但有層次，較其他治療組稍好，而37℃中藥塌漬組、扶他林組、32℃中藥塌漬組可見較少的細胞數(shù)量，分布比較亂，有局部細胞積聚，潮線較模糊，見圖1。

圖1 各組部分病理圖片結果(HE，×200)

2.2.2Mankin評分結果 模型組兔膝關節(jié)軟骨組織病理Mankin評分〔(11.00±0.82)分〕與空白組〔(1.50±0.50)分〕比較明顯升高(P<0.01)；治療組Mankin評分均明顯低于模型組(P<0.01)，高于空白組(P<0.05)；治療組組內比較Mankin評分從低到高依次是42℃中藥塌漬組〔(3.00±0.82)分〕、37℃中藥塌漬組〔(4.75±0.83)分〕、扶他林組〔(5.75±0.82)分〕、32℃中藥塌漬組〔(7.50±1.12)分〕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3不同組軟骨組織MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表達水平比較 模型組MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表達量均最高，空白組均最低，模型組與空白組有顯著差異(P<0.01)；治療組其 mRNA的表達量均低于模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療組內比較，42℃中藥塌漬組MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表達量均最低，其次從低到高依次是37℃中藥塌漬組、扶他林組、32℃中藥塌漬組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同組MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表達量

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；治療組組內比較：3)P<0.05

3 討 論

KOA形成的主要原因是膝關節(jié)軟骨降解、骨贅形成和軟骨損傷等，為了研究其形成的具體機制，人們發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路與KOA的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系〔8，9〕。而Wnt/β-catenin信號通路的作用途徑是當該信號通路被激活時，通過抑制降解復合物減少β-catenin的降解，使積累的β-catenin進入細胞核內與轉錄因子結合進而促進該信號通路下游基因表達，進而促進軟骨細胞的增殖分化和凋亡〔10〕。所以Wnt/β-catenin信號通路對KOA的調控主要取決于其下游基因的表達，主要有MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc。

MMPs一種由結締組織細胞分泌并參與細胞外基質降解的蛋白酶，可降解細胞外基質中的膠原、蛋白多肽等〔11〕。而KOA的主要是由于軟骨細胞外基質降解所致，所以MMPs在KOA的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用〔12〕。李保馳等〔13〕通過實驗發(fā)現(xiàn)MMPs蛋白與骨性關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展密切相關，且OA患者滑膜中表達明顯高于非OA患者。BMPs是一種生長因子，其可通過調節(jié)蛋白多糖的合成在軟骨保護和修復中發(fā)揮重要作用，其中BMP-2是促進骨形成和誘導成骨細胞分化最重要的細胞外信號分子之一。有研究表明BMPs在早期誘導軟骨細胞分化，促進基質合成，促進軟骨形成同時也參與了軟骨細胞的終末分化過程致使軟骨退化，促進OA形成〔14〕。詹宏鋼等〔15〕在研究獨活寄生湯對KOA的作用機制使發(fā)現(xiàn)活寄生湯可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因BMP-2轉錄，可保護關節(jié)軟骨，緩解關節(jié)疼痛。cyclinD1是細胞周期含量呈周期性變化的細胞周期調節(jié)蛋白，其調控細胞周期的進展過程，促進細胞增殖，所以其在正常細胞中處于低水平狀態(tài)〔16〕。結合其同為Wnt/β-catenin信號通路下游基因，其很有可能與軟骨細胞的增值、分化有很大關系。c-myc是一種轉錄因子，其可調控cyclinD1、cyclinE及p27等細胞周期相關基因的表達，促進細胞生長，c-myc的過度表達使細胞擺脫細胞周期的限制，導致細胞惡化，進入過度增殖的狀態(tài)。其不僅與腫瘤細胞生長增殖與分化相關，也有軟骨細胞的增殖、分化和凋亡相關〔17〕。

本實驗表明Wnt/β-catenin信號通路下游基因與KOA的發(fā)生發(fā)展有著密切關系，中藥塌漬法治療KOA療效明確，且適宜溫度的中藥溻漬法治療效果更佳。而中藥塌漬療法很有可能就是通過調控該信號通路，下調下游基因MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表達治療KOA。