席紅利 黃文瑾 尚彥彥

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 1檢驗科,廣東 廣州 510095；2放療四科)

外科手術(shù)切除并輔以放化療是臨床上常用的胃癌治療方案〔1，2〕，然而，術(shù)后復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者生存率低的主要因素，晚期胃癌患者術(shù)后5年生存率低于30%〔3〕，其中老年患者由于全身多器官明顯衰退，身體耐受力較差，其5年生存率通常低于平均值。腫瘤干細(xì)胞(CSCs)具有自我更新復(fù)制和多向分化等特性，是腫瘤復(fù)發(fā)的源頭〔4〕。分化抗原簇蛋白(CD)133是造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，同時也是乳腺癌〔5〕等腫瘤干細(xì)胞的重要標(biāo)志物。表觀遺傳修飾在CSCs分化為腫瘤細(xì)胞的過程中扮演重要角色，組蛋白去乙酰化酶(HDACs)是表觀遺傳修飾的關(guān)鍵酶，在眾多基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮作用〔6，7〕。研究證實，HDACs抑制劑能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，具有抗腫瘤功能〔8〕。本研究探討與CSCs密切相關(guān)的CD133和HDACs在術(shù)后復(fù)發(fā)的老年晚期胃癌患者的治療和預(yù)后評估中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2009年1月至2014年12月收集的老年晚期胃癌患者原發(fā)部位腫瘤組織標(biāo)本75例，所有標(biāo)本經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色后，經(jīng)3名有經(jīng)驗的病理醫(yī)師確診?；颊呔嬖谛g(shù)后復(fù)發(fā)，其中，男49例，女26例，年齡60～87〔平均(71.32±6.58)〕歲；腫瘤分期：T3～T4a期27例，T4b期48例；淋巴轉(zhuǎn)移：N0～N2期31例，N3期44例；無肝臟轉(zhuǎn)移(H0)23例，有肝臟轉(zhuǎn)移(H1)52例；無腹膜轉(zhuǎn)移(P0)19例，有腹膜轉(zhuǎn)移(P1)56例；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M0)11例，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M1)64例；分化程度：分化21例，未分化54例?；颊呔型暾呐R床資料，患者及其家屬對本研究知情同意。本研究符合醫(yī)院倫理委員會的相關(guān)規(guī)定，且已通過委員會的審核。

1.2試劑與方法 兔抗人CD133多克隆抗體(ab19898，美國Abcam公司)，兔抗人HDAC1多克隆抗體(ab19845，美國Abcam公司)，SP試劑盒(上海康朗生物科技有限公司)；3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。采用免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測CD133和HDAC1蛋白在癌組織中的表達(dá)水平。癌組織標(biāo)本均采用4%中性甲醛固定，后進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋、切片。取石蠟切片，進(jìn)行常規(guī)的脫蠟至水，置入3%的過氧化氫(H2O2)中，室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，采用微波爐進(jìn)行抗原熱修復(fù)，滴加正常山羊血清，在室溫下封閉20 min，棄去血清，滴加稀釋好的一抗(CD133，HDAC1的稀釋比例均為1∶100)，在37℃的環(huán)境下孵育2 h，PBS洗滌，滴加生物素二抗(稀釋比例1∶200)，在室溫下孵育30 min，PBS洗滌，DAB顯色，反復(fù)沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片。

1.3結(jié)果判定 癌組織標(biāo)本均選擇10個含有陽性細(xì)胞的高倍視野(×400)分別計數(shù)100個細(xì)胞，取其平均值計算陽性細(xì)胞百分率。陽性細(xì)胞百分率得分標(biāo)準(zhǔn)如下：<5%為0分；5%～24%為1分；25%～49%為2分；50%～74%為3分；≥75%為4分。染色程度的得分標(biāo)準(zhǔn)如下：無陽性著色為0分；淺黃色為1分；深黃色為2分；棕黃色為3分。最終得分為陽性細(xì)胞百分率得分與染色強度得分的乘積：分值為0～12分，若最終得分≥6分則判定為陽性，<6分則判定為陰性。

1.4統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗、Kaplan-Meier生存曲線法、Log Rank檢驗、受試者工作特征(ROC)曲線分析。

2 結(jié) 果

2.1CD133和HDAC1蛋白在晚期胃癌組織中的表達(dá) CD133蛋白的表達(dá)主要定位在細(xì)胞質(zhì)，HDAC1蛋白主要定位在細(xì)胞核。CD133蛋白在晚期胃癌組織中的陽性表達(dá)率為76.00%(57/75)，而HDAC1蛋白在晚期胃癌組織中的陽性表達(dá)率為53.33%(40/75)，晚期胃癌組織中CD133蛋白陽性表達(dá)率顯著高于HDAC1蛋白(χ2=3.014，P=0.015)，見圖1。

圖1 晚期胃癌組織中CD133和HDAC1蛋白表達(dá)(×400，IHC)

2.2CD133和HDAC1蛋白表達(dá)與老年晚期胃癌患者的臨床病理特征的關(guān)系 老年晚期胃癌患者組織中，CD133蛋白表達(dá)與腫瘤分期、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝臟轉(zhuǎn)移及腹膜侵襲均顯著相關(guān)(均P<0.05)，而與有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度無顯著相關(guān)性(均P>0.05)；HDAC1蛋白表達(dá)與腫瘤分期、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝臟轉(zhuǎn)移、腹膜侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無顯著相關(guān)性(均P>0.05)，與腫瘤分化程度顯著相關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 晚期胃癌組織中CD133和HDAC1陽性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.3晚期胃癌組織中CD133和HDAC1蛋白表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)系 以生存資料繪制Kaplan-Meier生存曲線，結(jié)果顯示：CD133陽性表達(dá)組(57例)平均術(shù)后生存時間為(17.21±1.04)個月，CD133陰性表達(dá)組(18例)的平均術(shù)后生存時間為(25.83±4.38)個月，兩組平均術(shù)后生存時間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.614，P=0.030)；HDAC1陽性表達(dá)組(40例)的平均術(shù)后生存時間為(30.89±2.94)個月，HDAC1陰性表達(dá)組(35例)的平均術(shù)后生存時間為(26.675±2.52)個月，兩組平均術(shù)后生存時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.909，P=0.167)，見圖2。

2.4CD133和HDAC1蛋白表達(dá)水平對生存預(yù)后的ROC曲線分析 以生存12個月作為預(yù)后判斷因變量，將75例樣本按CD133和HDAC1蛋白的染色指數(shù)分別分成0、1～2、3～5、6～8、9～12等5個組段，進(jìn)行ROC曲線分析。結(jié)果顯示，預(yù)后判斷閾值點為：CD133蛋白染色指數(shù)=3(理論閾值=2.9，敏感度0.742，特異度0.763)、HDAC1蛋白的染色指數(shù)=4(理論閾值=4.6，敏感度0.525，特異度0.513)。提示：胃癌患者CD133蛋白和HDAC1蛋白的染色指數(shù)分別高于3和4之后，其12個月生存概率將明顯下降。CD133、HDAC1指標(biāo)的ROC曲線的曲線下面積(AUC)分別為0.784，0.557，提示可能有一定的生存預(yù)后價值，但HDAC1蛋白的生存預(yù)測價值較低。見圖3。

圖2 CD133和HDAC1蛋白表達(dá)與患者術(shù)后生存時間的關(guān)系

圖3 CD133和HDAC1蛋白的染色指數(shù)對胃癌患者生存12個月的預(yù)測價值分析(ROC曲線)

3 討 論

胃癌是發(fā)病率最高的消化道腫瘤，死亡率僅次于肺癌，好發(fā)于50歲以上人群，近年來隨著我國老齡化進(jìn)程加快，胃癌患病率呈上升趨勢〔9〕。近年來，我國胃癌的整體治療效果已取得突破性進(jìn)展，其中胃癌根治切除術(shù)，已經(jīng)成為胃癌患者的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式〔10〕，然而胃癌患者的術(shù)后預(yù)后并不樂觀，尤其是晚期胃癌患者，術(shù)后復(fù)發(fā)是導(dǎo)致晚期胃癌患者不良預(yù)后甚至死亡的主要原因。CSCs與正常干細(xì)胞相似，具有自我更新復(fù)制、潛在多向分化及歸巢功能等，是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的根源。近幾十年來，針對CSCs的研究進(jìn)展迅速，探究CSCs表面標(biāo)記分子在腫瘤形成、侵襲轉(zhuǎn)移及化療耐藥中的作用，是目前的研究熱點〔11〕。

CD133又名Prominin-4，是由PROM1基因編碼的含有5次跨膜結(jié)構(gòu)的糖蛋白。研究表明，CD133特異性表達(dá)于多種腫瘤的CSCs表面，且CD133過表達(dá)常常與腫瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn)CD133高表達(dá)可能與胃癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，Liu等〔13〕研究也發(fā)現(xiàn)，局部誘導(dǎo)CD133表達(dá)，能夠促使肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)。本研究結(jié)果提示CD133可能參與并且增強了胃癌細(xì)胞的侵襲遷移能力，促進(jìn)胃癌的惡性進(jìn)展，與Ishiwata〔14〕在肝癌細(xì)胞中的研究結(jié)果一致，CD133陽性表達(dá)細(xì)胞比CD133陰性細(xì)胞具有更強的侵襲能力。本研究提示CD133表達(dá)陽性，術(shù)后生存時間更短，預(yù)示著患者的不良預(yù)后，Lu等〔15〕在胃癌中的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，CD133陽性表達(dá)胃癌患者的預(yù)后明顯較CD133陰性患者差。

CSCs分化成為腫瘤細(xì)胞的過程中，表觀遺傳修飾(如DNA甲基化，組蛋白修飾等)發(fā)揮極其重要的作用。甲基化和乙?；墙M蛋白最主要的兩種表觀遺傳修飾方式，組蛋白乙?；且环N高度動態(tài)可逆的共價修飾，HDACs與蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)協(xié)同參與維持組蛋白乙?；健?6〕。在前列腺癌中，HDAC1過表達(dá)是預(yù)示腫瘤復(fù)發(fā)、增殖和基因組不穩(wěn)定的獨立指標(biāo)〔17〕，在胃癌細(xì)胞中，HDAC1能夠抑制p21轉(zhuǎn)錄翻譯，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖〔18〕，對HDAC1表達(dá)水平的檢測，有助于對胃癌患者進(jìn)行預(yù)后評估〔19〕。Sudo等〔19〕在胃癌中關(guān)于HDAC1的研究結(jié)果顯示，HDAC1高表達(dá)與胃癌高惡性程度密切相關(guān)，可以作為患者預(yù)后預(yù)測的靶標(biāo)，而本研究與其結(jié)論并不一致，可能是樣本例數(shù)較少、研究對象為術(shù)后復(fù)發(fā)的老年晚期胃癌患者等因素的限制，后期研究將增加樣本數(shù)量，進(jìn)行大樣本分析，以得到更為可靠的結(jié)論。

綜上所述，CD133蛋白在晚期胃癌中異常高表達(dá)，檢測其表達(dá)水平對老年晚期胃癌患者的術(shù)后治療和預(yù)后判斷具有一定的意義。