王慧敏，王利，粘靖祺

（黑龍江省完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司，哈爾濱 150078）

硝酸鹽、亞硝酸鹽作為食品護(hù)色劑、防腐劑被廣泛應(yīng)用于腌臘、醬鹵、肉灌腸、發(fā)酵肉制品等食品中，以增強(qiáng)和改善肉制品的色澤，延長(zhǎng)保存時(shí)間。硝酸鹽在一定條件下可被還原為亞硝酸鹽，但鑒于過(guò)量的亞硝酸鹽對(duì)人體有一定危害，所以國(guó)家對(duì)硝酸鹽、亞硝酸鹽使用量和亞硝酸鹽的殘留量都做出了嚴(yán)格的限制。硝酸鹽、亞硝酸鹽雖可以作為食品添加劑，但在乳制品中是嚴(yán)禁使用的。牛乳中的亞硝酸鹽來(lái)源就成為控制的關(guān)鍵。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)乳粉中的亞硝酸鹽含量做了限量規(guī)定，其含量（以NaNO2計(jì)）不得大于2mg/kg[1]。乳制品中亞硝酸鹽的來(lái)源有多方面因素，一是自然界廣泛存在這種化合物，因此，哺乳動(dòng)物的乳汁分泌和形成過(guò)程中就已含有此類物質(zhì)；如有研究報(bào)道，對(duì)6只大鼠舌表面細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)、分離、純化，從中發(fā)現(xiàn)4個(gè)屬的具有硝酸鹽還原性的優(yōu)勢(shì)菌[2]。二是硝酸鹽和亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化。自然界中確實(shí)存在一些微生物具有將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽的能力。董競(jìng)等[3]從侗族酸肉中篩選出9株具有硝酸鹽還原能力的菌株，其中2株硝酸鹽還原能力較高；何燕飛等[4]從浙江省特色腌魚制品中也分離出兩株硝酸鹽還原菌菌株。乳制品中含有豐富的含氮有機(jī)物，其在微生物的作用下可逐漸分解成氨，氨可進(jìn)一步被微生物轉(zhuǎn)化為硝酸鹽和亞硝酸鹽，硝酸鹽在一定條件下亦可還原為亞硝酸鹽。因此，如能有效控制生乳中的相關(guān)微生物，對(duì)亞硝酸鹽的控制可以起到輔助性作用。

本試驗(yàn)以生乳中的微生物為研究對(duì)象，對(duì)生乳中的硝酸鹽還原菌進(jìn)行了分離、純化，進(jìn)而進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以期為控制乳制品生產(chǎn)中由硝酸鹽還原菌引起的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

生乳樣品：混合生乳樣品。

PCA培養(yǎng)基[5]：胰蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，瓊脂15.0g，將上述成分溶于1 000mL蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)值pH至7.0±0.2，分裝于適宜的容器中，121℃高壓滅菌15min。

磷酸鹽緩沖液：磷酸二氫鉀（KH2PO4）34.0g，蒸餾水500mL，pH7.2；貯存液：將34.0gKH2PO4溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL的1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，用蒸餾水稀釋至1 000mL后貯存于冰箱；稀釋液：取貯存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至1 000mL，分裝于適宜的容器中，121℃高壓滅菌15min。

MPC瓊脂培養(yǎng)基[6]：胰蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，無(wú)抗脫脂奶粉1.0g，將上述成分溶于1 000mL蒸餾水中，用15%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.1。加入瓊脂10～15g，煮沸使瓊脂融化。必要時(shí)使用兩層紗布（夾脫脂棉）過(guò)濾，分裝于適宜的容器中，121℃高壓滅菌15min。

DTA培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g，葡萄糖5.0g，2%溴甲酚紫乙醇溶液2mL，將上述成分溶于1 000mL蒸餾水中，用15%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.9±0.1。加入瓊脂10～15g，煮沸使瓊脂融化。分裝于適宜的容器中，121℃高壓滅菌15min。

硝酸鹽還原培養(yǎng)基[7]：蛋白胨1.0g，NaCl 0.5g，KNO30.1～0.2g，pH7.4，分裝于試管中，121℃高壓滅菌15min。

1.2 方法

1.2.1 生乳中微生物的分離

以無(wú)菌吸管吸取25mL混合生乳樣品至盛有225mL磷酸緩沖液的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成10-1的樣品勻液。用1mL無(wú)菌微量移液器吸取10-1樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL磷酸緩沖液的無(wú)菌試管中，振搖試管，制成10-2的樣品勻液，以此方法配制10-1～10-6的稀釋液，每遞增稀釋一次，換用一次無(wú)菌微量移液器吸頭。各取1mL均勻涂布于PCA平板中，平行涂布3板；同時(shí)，分別吸取1mL磷酸緩沖液加入兩個(gè)無(wú)菌平板中作為空白對(duì)照，36±1℃培養(yǎng)48±2h。

嗜冷菌分離：取各梯度稀釋液1mL均勻涂布于MPC平板中，平行涂布3板；同時(shí)，分別吸取1mL磷酸緩沖液加入兩個(gè)無(wú)菌平板中作為空白對(duì)照，于6.5±0.5℃培養(yǎng)10d，培養(yǎng)皿堆疊不超過(guò)6個(gè)。

需氧芽孢菌分離：將混合生乳樣品經(jīng)80℃加熱處理10min，按上述方法制成10-1～10-6的稀釋液，取各梯度稀釋液1mL均勻涂布于MPC平板中，平行涂布3板；同時(shí)，分別吸取1mL磷酸緩沖液加入兩個(gè)無(wú)菌平板中作為空白對(duì)照，36±1℃培養(yǎng)48±2h。

嗜熱芽孢菌分離：將混合生乳樣品經(jīng)100℃加熱處理30min，按上述方法制成10-1至10-6的稀釋液。取各梯度稀釋液1mL均勻涂布于DTA平板中，平行涂布3板；同時(shí)，分別吸取1mL磷酸緩沖液加入兩個(gè)無(wú)菌平板中作為空白對(duì)照，55±1℃培養(yǎng)48±2h。

待長(zhǎng)出明顯菌落后，從最高稀釋倍數(shù)的平板中挑取單個(gè)菌落，以平板劃線的方式多次純化，鏡檢，初篩分離出菌落形態(tài)不同的純化菌株。

1.2.2 硝酸鹽還原菌的篩選

將分離純化的菌株接種于裝有硝酸鹽還原培養(yǎng)基的試管中，每個(gè)菌株接種2支并編號(hào)，保留2支空白試管作為對(duì)照，37±1℃培養(yǎng)48±2h。觀察結(jié)果時(shí)，在試管中加入幾滴Griess試劑，若出現(xiàn)紅色，則說(shuō)明具備硝酸鹽還原性；如未變紅，在對(duì)應(yīng)編號(hào)的另一支試管中加入鋅粉，搖動(dòng)，37℃培養(yǎng)30min，加入Griess試劑，出現(xiàn)紅色，證明培養(yǎng)基中的硝酸鹽仍然存在，如不出現(xiàn)紅色，則說(shuō)明硝酸鹽已被進(jìn)一步還原。以此方法篩選出具備硝酸鹽還原能力的菌株。

1.2.3 硝酸鹽還原菌的分子生物學(xué)鑒定

變性：從培養(yǎng)基中挑取菌體于50μL TaKaRa（寶生物）微生物直接裂解 PCR緩沖液中，變性后離心取上清液作為模板，反應(yīng)條件80℃，15min。使用TaKaRa（寶生物） 16S rDNA 細(xì)菌鑒定 PCR 試劑盒擴(kuò)增目的片段。取變性反應(yīng)液1μL，PCR預(yù)混液25μL，上、下游引物各0.5μL(20pmol/μL),定容至50μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，循環(huán)30次；72℃終延伸5min。

使用TaKaRa （寶生物）MiniBEST 瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒切膠回收目的片段進(jìn)行DNA測(cè)序，然后在GenBank中比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝酸鹽還原性測(cè)試

通過(guò)硝酸鹽還原試驗(yàn)，分離出具備硝酸鹽還原能力的菌株5株，如圖1所示，編號(hào)為BA-1、BA-2、BA-3、BA-4和BA-5。

圖1 硝酸鹽還原顯色反應(yīng)

2.2 分子生物學(xué)鑒定

將菌株BA-1、BA-2、BA-3、BA-4、BA-5的PCR產(chǎn)物，各取5μL進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。

圖2 3%瓊脂糖凝膠電泳圖

將菌株BA-1、BA-2、BA-3、BA-4、BA-5的16S rDNA測(cè)序結(jié)果和GenBank已發(fā)布的菌株進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

系統(tǒng)發(fā)育樹（系統(tǒng)進(jìn)化樹）是研究生物進(jìn)化和系統(tǒng)分類中常用的一種樹狀分枝的圖形，樹枝上的數(shù)字表示bootstrap驗(yàn)證中該樹枝可信度的百分比，用來(lái)概括表示各種（類）生物之間的親緣關(guān)系。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹需要做Bootstrap檢驗(yàn)，一般Bootstrap值大于70，認(rèn)為構(gòu)建的進(jìn)化樹較為可靠。當(dāng)Bootstrap值過(guò)低時(shí)，所構(gòu)建的進(jìn)化樹其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可能存在問(wèn)題，進(jìn)化樹不可靠。

通過(guò)對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示：

圖3 相關(guān)菌株序列的16S rDNA基因序列的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹[原始樹（original tree），結(jié)點(diǎn)處數(shù)值為bootstrap值，括號(hào)外為序列登錄號(hào)]

采用Mega3.1軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）和序列同源性比對(duì)（表1）可知，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上，BA-1、BA-3、BA-4與蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌聚在一起；BA -2與波茨坦短芽孢桿菌聚在一起；BA -5與luciferensis芽孢桿菌聚在一起。

表1 序列同源性比對(duì)表

一般認(rèn)為，16S rDNA序列同源性＞99%，可以認(rèn)為屬于同一個(gè)種；16S rDNA序列同源性＜97%，可以認(rèn)為屬于不同的種；16S rDNA序列同源性小于93%，可以認(rèn)為屬于不同的屬。

3 結(jié)論

由以上結(jié)果可以看出：生乳中存在可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的微生物，BA-1、BA-3、BA-4為蠟樣芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌；BA-2為波茨坦短芽孢桿菌；BA-5為芽孢菌屬細(xì)菌。

從健康的奶牛乳房中剛擠下的牛乳中微生物數(shù)量極少，但由于擠乳的操作過(guò)程、器具、空間環(huán)境、貯存條件等因素都能增加生乳中的微生物種類和數(shù)量，且生乳中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，在適宜的溫度條件下，微生物可快速繁殖。生乳中微生物的種類和數(shù)量可以通過(guò)加強(qiáng)乳牛場(chǎng)和乳品加工廠的日常衛(wèi)生管理，實(shí)行有效的冷卻處理和預(yù)殺菌工藝等措施加以控制和降低。降低生乳中的微生物數(shù)量，對(duì)生乳品質(zhì)的提升至關(guān)重要。此外，鑒于微生物的分離、篩選具有隨機(jī)性，生乳中可能還存在其他具備硝酸鹽還原能力的微生物，對(duì)此還有待研究。