文鵬程 隋馨瑤 孫二娜 趙 亮,3 任發(fā)政, 王 瑩

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 蘭州 730070； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院， 北京 100083； 3.河北省畜產(chǎn)食品工程技術(shù)研究中心， 三河 065200)

0 引言

航天誘變技術(shù)又稱“空間誘變技術(shù)”，它是利用返回式衛(wèi)星將植物種子送入太空，利用其特殊的環(huán)境，對(duì)種子進(jìn)行多項(xiàng)誘變處理，改變種子自身的基因，從而獲得有益突變[1]，有利于選育出變異幅度大的特異質(zhì)的菌種新品種。隨著研究的深入，我國(guó)利用航天誘變技術(shù)開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品已經(jīng)具備一定優(yōu)勢(shì)，其研究水平已經(jīng)位居世界前列。近年來(lái)，利用航天育種技術(shù)已經(jīng)培育出80多個(gè)農(nóng)作物新品種，并已經(jīng)投入生產(chǎn)[2]。魏麗勤等[3]通過(guò)返回式衛(wèi)星，對(duì)泰樂(lè)菌素的最終產(chǎn)量進(jìn)行了空間誘變，測(cè)定了弗氏鏈霉菌產(chǎn)泰樂(lè)菌素比出發(fā)菌株增加了74.6%。周方方等[4]通過(guò)空間誘變的方法，將干酪乳桿菌LC2W在胞外多糖上進(jìn)行篩選，通過(guò)篩選得到了高產(chǎn)胞外多糖的3個(gè)菌株(LC2W-1、LC2W-2、LC2W-3)，并將其進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性的測(cè)定，結(jié)果表明，這3株菌的胞外多糖產(chǎn)量相對(duì)出發(fā)菌株增加了41.78%、26.15%、32.40%，胞外多糖質(zhì)量濃度達(dá)到191.48、170.36、178.81 mg/L，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。李雄超等[5]將干酪乳桿菌G5送上太空，利用神舟八號(hào)飛船進(jìn)行太空搭載，使菌株進(jìn)入太空，產(chǎn)生突變。經(jīng)過(guò)誘變后的菌株，進(jìn)行了高產(chǎn)胞外多糖的篩選，獲得了2株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌，經(jīng)過(guò)誘變后的菌株胞外多糖的產(chǎn)量分別提高了1.9、1.7倍。

干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)屬于益生菌菌種。該菌種分布范圍廣，在奶酪、酸奶以及泡菜中均有發(fā)現(xiàn)，也存在于人體的口腔及腸道中[6]，可有效抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，維持腸道的生態(tài)平衡和正常功能。同時(shí)，它可以降低膽固醇含量，增強(qiáng)免疫反應(yīng)，控制腹瀉、緩解乳糖不耐受，抑制腸道病原菌，是一種益生菌菌種[7-9]。

副干酪乳桿菌L105是課題組從云南大理的乳扇中進(jìn)行分離篩選后又經(jīng)過(guò)耐酸、耐氧適應(yīng)性馴化得到的。副干酪乳桿菌L105搭載于“神舟十一號(hào)”飛船經(jīng)過(guò)33 d后返回。本文研究航天誘變篩選得到的高產(chǎn)酸菌株A-4-2的生長(zhǎng)特性、形態(tài)學(xué)特性、耐受性及β-半乳糖苷酶活性、基因表達(dá)量，以期為該菌株的應(yīng)用提供一定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1菌株來(lái)源

研究對(duì)象為副干酪乳桿菌A-4-2，該菌株是副干酪乳桿菌L105經(jīng)航天誘變后篩選得到的高產(chǎn)酸菌株。副干酪乳桿菌L105(出發(fā)菌株)為從云南大理的乳扇中進(jìn)行分離篩選的副干酪乳桿菌L9(野生菌株)進(jìn)行耐酸、耐氧適應(yīng)性馴化后得到的，該菌株具有良好的發(fā)酵性能。

1.1.2培養(yǎng)基

MRS(乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基)液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，酵母浸粉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸二銨2 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.58 g，硫酸錳(MnSO4·H2O)0.2 g，吐溫80(Tween-80) 1 mL，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH值至6.5。

MRS固體培養(yǎng)基：培養(yǎng)基成分同液體培養(yǎng)基，1 L添加瓊脂15 g。

MRS耐膽鹽培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中膽鹽含量根據(jù)試驗(yàn)要求添加。

以上培養(yǎng)基均121℃滅菌15 min；12%脫脂乳培養(yǎng)基，110℃滅菌10 min；保護(hù)劑為12%脫脂乳中加入30%甘油。

1.1.3主要儀器及設(shè)備

XSZ-4G型顯微鏡，COIC公司；TGL-16B型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；LDZM型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DELTA320型 pH計(jì)，METTLER-TOELDO公司；H1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DK-98-II2KW型潔凈工作臺(tái)，天津泰斯特儀器公司；UV-2102PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海Unico公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Bioscreen C型全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，芬蘭Bioscreen公司；JY96-N型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，JY99-IIDN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；N203型組織研磨器，美國(guó)Biospec公司；Model-680型自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司；LightCycler 96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))儀，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌株形態(tài)學(xué)鑒定

革蘭氏染色：將篩選出來(lái)的高產(chǎn)酸菌株A-4-2與L9、L105接種、活化后，分別等量接種于pH值為6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，在有氧條件下37℃連續(xù)培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行革蘭氏染色，電子顯微鏡觀察。

透射電鏡：將菌株A-4-2與L9、L105接種、活化后，分別等量接種于pH值為6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，在有氧條件下37℃連續(xù)培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行透射電鏡樣品處理：取大量樣品離心(轉(zhuǎn)速3 000～4 000 r/min)，去除上清液，加入適當(dāng)pH值(7.2～7.4)的0.1 mol/L PBS(磷酸鹽緩沖液)清洗3次，清洗時(shí)菌體懸?。?.5%戊二醛固定3 h，用PBS清洗2次，每次10 min。再用純水清洗2次，用透射電鏡Tecnai G2 F20 S-TWIN型(200 kV)觀察。

1.2.2菌株保藏

經(jīng)過(guò)鑒定后，確定為副干酪乳桿菌的菌株，將其接種在新鮮的pH值6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，將其放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h左右，將培養(yǎng)后的菌液在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行轉(zhuǎn)移，將其轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中離心10 min(4 200～4 500 r/min)，棄去上清液，加入保護(hù)劑2 mL，充分混勻，用移液槍吸取1 mL分裝于1.5 mL離心管中，于-20℃中保存[10]。

1.2.3菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將菌株A-4-2與L9、L105接種、活化2代后，按1%接種量分別接種于pH值為6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，用Bioscreen C型全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，在有氧條件下37℃連續(xù)培養(yǎng)24 h，測(cè)定波長(zhǎng)600 nm處菌懸液的光密度，繪制600 nm處光密度(OD值)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)曲線[11]。

1.2.4菌株耐酸能力評(píng)價(jià)

低pH值下菌株致死率：待測(cè)菌株接種、活化后，按1%接種量分別接種于pH值為6.5的MRS培養(yǎng)基中，在有氧條件下37℃連續(xù)培養(yǎng)16 h后，離心收集菌體，將菌體沉淀分別接入pH值為3.5、3.0和2.5的MRS培養(yǎng)基中，并在37℃下分別培養(yǎng)0、2、4 h時(shí)，對(duì)菌株進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算菌株致死率。每組試驗(yàn)至少有3個(gè)重復(fù)[12]。

發(fā)酵7 d后菌株耐酸能力評(píng)價(jià)：將待測(cè)菌株進(jìn)行37℃靜置12 h活化后，按1%接種量分別接種于12%的脫脂乳培養(yǎng)基中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，連續(xù)發(fā)酵7 d后，將發(fā)酵乳樣品充分混勻，并吸取1 mL樣品分別加到pH值為3.5、3.0、2.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃下分別培養(yǎng)0、2、4 h時(shí)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。每組試驗(yàn)至少有3個(gè)重復(fù)。

1.2.5菌株耐膽鹽能力評(píng)價(jià)

待測(cè)菌株接種、活化后，按1%接種量分別接種于pH值為6.5的MRS培養(yǎng)基中，在有氧條件下37℃連續(xù)培養(yǎng)16 h后，離心收集菌體，將菌體沉淀分別接入膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%和0.3%的MRS膽鹽培養(yǎng)基中，37℃下分別培養(yǎng)0、1、2、3、4 h，對(duì)菌株進(jìn)行平板計(jì)數(shù)計(jì)算菌株致死率。每組試驗(yàn)至少有3個(gè)重復(fù)[12-13]。

1.2.6菌株產(chǎn)胞外多糖能力評(píng)價(jià)

(1)胞外多糖的分離與含量測(cè)定

將待測(cè)菌株經(jīng)37℃靜置12 h活化后，按1%的接種量接種于10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的脫脂乳培養(yǎng)基中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，連續(xù)發(fā)酵7 d，在發(fā)酵1、3、5、7 d時(shí)取發(fā)酵乳樣品10 mL，向其加入3 mL 16 g/(100 mL)的三氯乙酸溶液，放入4℃冰箱放置2 h后，10 000g離心30 min，取上清液備用；取6 mL上清液，并加入等體積的無(wú)水乙醇，4℃靜置12 h；將混合液10 000g離心30 min，取沉淀，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的含量[14-18]。

(2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用萬(wàn)分之一天平稱取葡萄糖 0.10 g，于100 mL容量瓶中，加入少量蒸餾水溶解，定容搖勻。從100 mL容量瓶中，分別吸取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 葡萄糖溶液，加入10 mL容量瓶中，定容搖勻。蒸餾水做空白對(duì)照。吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，于室溫(20℃)下在其中加入5%苯酚1 mL并搖勻，再快速加入5 mL濃硫酸。待反應(yīng)結(jié)束溶液冷卻至室溫時(shí)，用紫外分光光度計(jì)于490 nm處測(cè)其吸光度?？瞻讟右? mL蒸餾水按照同樣的步驟進(jìn)行[19-20]。獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為：y=0.009x+0.136，R2=0.999。

(3)樣品中胞外多糖含量的測(cè)定

取1 mL樣液，于室溫下在其中加入5%苯酚1 mL并搖勻，再快速加入5 mL濃硫酸。待反應(yīng)結(jié)束溶液冷卻至室溫時(shí)，用紫外分光光度計(jì)于490 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中胞外多糖含量。

1.2.7菌株表面疏水性評(píng)價(jià)

待測(cè)菌株接種、活化后，1%接種量分別接種于pH值為6.5的MRS培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，于有氧條件下連續(xù)培養(yǎng)12 h后，離心(4 200～4 500 r/min，10～17 min)棄去上清液，將菌體沉淀用PBS溶液(pH值7.2)洗滌兩次，重懸于0.1 mL/L KNO3(pH值6.2)中，將菌懸液菌體濃度調(diào)整為1×108CFU/mL，同時(shí)測(cè)定菌懸液在600 nm處的吸光度A0。取上述3 mL菌懸液與1 mL二甲苯混合，室溫放置10 min后漩渦混合2 min，再于室溫下放置20 min，測(cè)定600 nm處水相的吸光度A1。表面疏水性指數(shù)以細(xì)菌黏附有機(jī)溶劑的百分率A來(lái)表示，計(jì)算公式為[21]

A=(1-A1/A0)×100%

1.2.8菌株β-半乳糖苷酶活力測(cè)定

(1)發(fā)酵過(guò)程中乳糖酶提取

將活化后的待測(cè)菌株按1%接種量接入12%脫脂乳培養(yǎng)基中，37℃連續(xù)發(fā)酵7 d。分別取發(fā)酵1、3、5、7 d的酸奶樣品10 mL，用1 mol/L NaOH中和至pH值6.5，加入1%的檸檬酸三鈉以使酪蛋白膠束溶解，離心(4℃，10 000g，10 min)，棄去上清液；將菌體細(xì)胞沉淀用PBS磷酸緩沖溶液(pH值6.5)洗滌3次，得菌體沉淀。將菌體細(xì)胞懸浮于0.01 mol/L PBS(pH值6.5)中，進(jìn)行超聲破碎，注意將樣品始終保持在冰浴中，離心(4℃，12 000g，5 min)，得酶提取液，待測(cè)酶活[22]。

(2)樣品中β-半乳糖苷酶活力測(cè)定

ONP(鄰-硝基苯酚)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參照文獻(xiàn)[23]。濃度梯度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 μmol/mL，按下面方法制備：準(zhǔn)確稱取139 mg ONP于1 000 mL容量瓶中，用10 mL 95%的乙醇溶解，用水稀釋定容，混勻。用移液管分別取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 mL上述配制溶液，分別加到100 mL容量瓶中，每個(gè)容量瓶中加入25 mL Na2CO3溶液(50 g Na2CO3和37.2 g EDTA(乙二胺四乙酸)于1 000 mL容量瓶中，少量水溶解稀釋)，用磷酸鹽緩沖液稀釋，混勻。以水作空白，用10 mm比色杯在420 nm下測(cè)定每個(gè)ONP標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以O(shè)NP濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程式為：y=0.006x+0.003，R2=0.998。

采用ONPG(臨-硝基酚-β-D-吡喃半乳糖苷)為酶作用底物，生成有色產(chǎn)物ONP，通過(guò)比色法測(cè)定，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品做3個(gè)重復(fù)，每次重復(fù)測(cè)定3次后取平均值。反應(yīng)體系：50 mmol/L PBS(pH值6.5)、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L 2-巰基乙醇、2.32 mmol/L ONPG和2 mg/mL酶提取液，37℃水浴反應(yīng)30 min，在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。在此條件下，每分鐘從底物ONPG中釋放出1 μmol ONP所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。酶提取液蛋白濃度測(cè)定參照試劑盒進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為：y=0.561x-0.002，R2=0.995。

1.2.9菌株β-半乳糖苷酶基因表達(dá)量測(cè)定

酸奶樣品中RNA提取：經(jīng)活化的菌株按1%接種量接入12%脫脂乳中，37℃連續(xù)發(fā)酵7 d。分別取發(fā)酵1、3、5、7 d的酸奶樣品10 mL，加入20 mL 1% EDTA(pH值12.0)混勻，離心(4℃，10 000g，10 min)，棄去上清液；將菌體細(xì)胞沉淀用磷酸緩沖溶液(pH值6.5)洗滌1次，得菌體沉淀。每個(gè)時(shí)間樣品做3個(gè)重復(fù)。核酸提取參照VANDECASTEELE等[24]的方法進(jìn)行。提取的核酸樣品用70%預(yù)冷乙醇洗滌，離心(4℃，12 000g，5 min)，棄上清液，室溫干燥5～10 min，加入20 μL DEPC(焦炭酸二乙酯)水測(cè)濃度。并立即用abm反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

引物的設(shè)計(jì)和合成：選取16S rDNA作為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列，采用NCBI中BLAST在線引物合成軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

β-半乳糖苷酶基因擴(kuò)增引物：上游引物5′-ATGGAATTCTGGGACGGCTG-3′；下游引物5′-TAGGAAGTCACTTGCGGCAG-3′。16S rDNA內(nèi)標(biāo)引物：上游引物5′-TCTTGGCTGAAAGATGGCGT-3′；下游引物5′-TTGCTCCATCAGACTTGCGT-3′。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，采用20 μL反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL、上下游引物各1 μL、dd H2O 7 μL、SYBR Premix試劑10 μL；real-time PCR反應(yīng)程序：50℃ 2 min，95℃ 10 min，(95℃ 15 s，58℃ 30 s，40個(gè)循環(huán))，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s。每個(gè)樣品設(shè)定3個(gè)平行，每次平行試驗(yàn)做3次生物學(xué)重復(fù)。采用ΔΔCt法計(jì)算基因的表達(dá)量[25]，利用內(nèi)參基因擴(kuò)增的Ct值進(jìn)行校正，以發(fā)酵1 d樣品的β-半乳糖苷酶基因表達(dá)量為參照，計(jì)算其它樣品中β-半乳糖苷酶基因的相對(duì)表達(dá)量F=2-ΔΔCt，ΔΔCt表示處理樣本和對(duì)照樣本間校正過(guò)的循環(huán)數(shù)變化量。

1.2.10數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

全部試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016和SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，運(yùn)用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，平均值由3個(gè)重復(fù)值所得。所有單因素方差檢驗(yàn)均采用Duncan’s新多變域測(cè)定法，且用P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

按照1.2.1節(jié)的方法，對(duì)菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果如圖1、2所示，電子顯微鏡結(jié)果顯示，3株菌形態(tài)均呈桿狀，排列方式呈鏈狀，并無(wú)明顯差別；透射電鏡結(jié)果也顯示，3株菌形態(tài)并無(wú)明顯差別。

2.2 菌株生長(zhǎng)曲線評(píng)價(jià)

為了解突變菌株的生長(zhǎng)情況，測(cè)定了突變菌株A-4-2與L105、L9在600 nm處27 h的光密度(OD值)，結(jié)果如圖3所示。副干酪乳桿菌27 h培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)時(shí)間與OD值的關(guān)系:0～12 h期間，OD值不斷提高，培養(yǎng)16 h時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)穩(wěn)定期，此后曲線趨于平緩，曲線呈S型。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得到，A-4-2突變菌株在有氧條件下的生長(zhǎng)情況基本與野生株L9保持一致，表明了其產(chǎn)酸性能提高的同時(shí)，又不失其原有生長(zhǎng)特性。

圖1 革蘭氏染色顯微鏡觀察Fig.1 Microscopic observation of gram stain

圖2 透射電鏡觀察結(jié)果Fig.2 Observation result of transmission electron microscope

圖3 副干酪乳桿菌27 h生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of Lactobacillus paracasei for 27 h

2.3 菌株耐酸能力評(píng)價(jià)

根據(jù)1.2.4節(jié)的方法對(duì)出發(fā)菌株L105和突變株A-4-2的耐酸能力進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示。在不同pH值的培養(yǎng)液中，活菌數(shù)明顯有所下降，說(shuō)明在酸性環(huán)境下，副干酪乳桿菌的生長(zhǎng)受到了抑制，對(duì)菌體代謝活動(dòng)多需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及能量有所減少，對(duì)菌體的存活產(chǎn)生了一定的影響。如表1所示，在pH值3.5培養(yǎng)1 h與2 h，突變株較野生株的存活率顯著升高(P<0.05)，而在pH值3.0與pH值2.5條件下，突變株與野生株各時(shí)間存活率在pH值3.0培養(yǎng)1 h和2 h及pH值2.5培養(yǎng)1 h有顯著差異(P<0.05)，其他培養(yǎng)時(shí)間無(wú)明顯差異，且存活率較低，說(shuō)明突變株維持了良好的耐酸能力。

注：每列相同字母表示不同菌株間無(wú)顯著性差異；每列不同字母表示不同菌株間有顯著性差異且P<0.05，下同。

根據(jù)1.2.4節(jié)發(fā)酵7 d后菌株耐酸能力評(píng)價(jià)的方法對(duì)突變菌株發(fā)酵7 d后的耐酸能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，如表2所示。0 h時(shí)，突變株的活菌菌體濃度為8.28 lgCFU/mL，在pH值為3.5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h后，活菌有所下降，達(dá)到8.20 lgCFU/mL，而在pH值為3.0和2.5的培養(yǎng)基中，菌數(shù)下降得更為明顯，分別為8.17 lgCFU/mL和8.01 lgCFU/mL，同時(shí)結(jié)果顯示，培養(yǎng)2 h和4 h后，不同pH值條件下，突變菌株的活菌數(shù)均顯著高于野生菌株L9(P<0.05)。說(shuō)明突變菌株在發(fā)酵7 d后，在酸性環(huán)境下的生長(zhǎng)能力受到明顯的抑制。

2.4 菌株耐膽鹽能力評(píng)價(jià)

益生菌潛在的另一個(gè)重要特性是它們能夠存活于人類小腸內(nèi)的膽汁中，在大腸中定植并繁殖。本研究對(duì)野生株L9和突變株A-4-2的耐膽鹽能力進(jìn)行比較，結(jié)果如表3所示。在不同膽鹽濃度的培養(yǎng)液中，副干酪乳桿菌L105活菌數(shù)隨膽鹽濃度的升高數(shù)量減少，副干酪乳桿菌在高膽鹽濃度條件下生長(zhǎng)受到抑制。

表2 副干酪乳桿菌發(fā)酵7 d后不同pH值下菌株存活情況Tab.2 Survival of Lactobacillus paracasei under different pH value conditions after 7 d fermentation

表3 副干酪乳桿菌不同膽鹽濃度下菌株存活情況Tab.3 Survival of Lactobacillus paracasei under different bile salt concentrations

由表3可知，0.1%膽鹽條件下培養(yǎng)2 h，突變株與野生株存活率基本相同，且存活率保持在40%左右；相比于含0.1%膽鹽的培養(yǎng)條件，0.2%與0.3%膽鹽含量的兩株菌存活率明顯下降(P<0.05)，說(shuō)明膽鹽對(duì)于副干酪乳桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用。在膽鹽環(huán)境培養(yǎng)2 h過(guò)程中，僅0.2%膽鹽時(shí)，突變株存活率顯著高于野生株，其他濃度突變株與野生株的存活率無(wú)顯著性差異，說(shuō)明航天誘變沒(méi)有降低副干酪乳桿菌對(duì)膽鹽的耐受能力。

2.5 菌株產(chǎn)胞外多糖能力評(píng)價(jià)

乳酸菌胞外多糖(EPSs)通常以與細(xì)菌細(xì)胞表面相關(guān)聯(lián)的膠囊或分泌到周圍介質(zhì)中的粘液兩種形式存在。近年來(lái)由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)引起了相當(dāng)多的關(guān)注[26]。EPSs可直接應(yīng)用于發(fā)酵乳制品，以增強(qiáng)其質(zhì)地和流變特性[27]。將菌株所制備的發(fā)酵乳樣品進(jìn)行胞外多糖的測(cè)定。突變菌株A- 4-2具有較高的產(chǎn)胞外多糖的能力，其胞外多糖產(chǎn)量為419.78 mg/L。相比而言，出發(fā)菌株L105的胞外多糖產(chǎn)量為415.11 mg/L，而突變菌株A-4-2的產(chǎn)胞外多糖能力比出發(fā)菌株L105略高。因此，說(shuō)明航天誘變沒(méi)有降低副干酪乳桿菌產(chǎn)胞外多糖的能力。

2.6 菌株表面疏水性評(píng)價(jià)

益生菌可有效調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)，這種能力與益生菌的黏附能力相關(guān)[28]，而對(duì)益生菌黏附能力的研究中發(fā)現(xiàn)，菌株的表面疏水性可以影響其黏附能力，并且是重要的因素之一[29]。表面疏水性越高，細(xì)菌黏附能力越強(qiáng)[30]。

本文測(cè)定了突變菌株與L105對(duì)二甲苯的疏水能力。突變菌株與L105疏水性存在顯著差異(P<0.05)。通常，高度疏水性的菌株具有很強(qiáng)的附著細(xì)胞的能力。但有研究表明，一株菌株對(duì)細(xì)胞的黏附率為40%，而該菌株的表面疏水能力極低。因此，疏水性可以促進(jìn)粘附，但強(qiáng)疏水性并不是強(qiáng)粘附的必要條件。

2.7 菌株β-半乳糖苷酶活力評(píng)價(jià)

經(jīng)過(guò)全基因組測(cè)序后，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其中與產(chǎn)酸相關(guān)的基因發(fā)生突變。為了進(jìn)一步研究產(chǎn)酸提高的原因，本試驗(yàn)對(duì)其產(chǎn)酸關(guān)鍵酶，即β-半乳糖苷酶進(jìn)行了研究。測(cè)定了副干酪乳桿菌發(fā)酵7 d內(nèi)的β-半乳糖苷酶比活力，結(jié)果如圖4所示。

圖4 β-半乳糖苷酶比活力Fig.4 β-galactosidase specific activity

發(fā)酵7 d內(nèi)，β-半乳糖苷酶比活力呈明顯上升趨勢(shì)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大(P<0.05)。雖然出發(fā)菌株與突變菌株酶比活力都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，突變菌株酶比活力增長(zhǎng)的速率顯著高于出發(fā)菌株(P<0.05)。發(fā)酵7 d后，突變菌株的酶活力顯著高于出發(fā)菌株L105(P<0.05)，這與試驗(yàn)前期測(cè)定的滴定酸度的變化保持一致。由圖4可知，發(fā)酵1 d時(shí)，菌株的產(chǎn)酸能力以及酶活力較低，可能是由于發(fā)酵初期，菌株經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的一部分β-半乳糖苷酶與培養(yǎng)基中的乳糖產(chǎn)生反應(yīng)，形成了酶復(fù)合物，從而使乳糖得到分解，生成葡萄糖和半乳糖，致使β-半乳糖苷酶的活力較低[31-32]。隨著發(fā)酵時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，菌株產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶活力逐漸增強(qiáng)，促進(jìn)了發(fā)酵過(guò)程中低聚糖的產(chǎn)生，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，代謝過(guò)程中的低聚糖逐漸增加，當(dāng)累積到一定值時(shí)，可充當(dāng)益生元，進(jìn)而對(duì)菌體生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用，提升了菌株細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶的活力，最終提高了菌株的產(chǎn)酸能力。

2.8 菌株β-半乳糖苷酶基因表達(dá)量評(píng)價(jià)

為了更進(jìn)一步研究產(chǎn)酸提高的原因，從基因水平采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，對(duì)菌株在發(fā)酵過(guò)程中β-半乳糖苷酶基因表達(dá)量進(jìn)行了研究，如圖5所示。將發(fā)酵1 d的β-半乳糖苷酶基因的表達(dá)量作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)隨著菌株發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，β-半乳糖苷酶基因的表達(dá)量呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)；發(fā)酵7 d后，各菌株中的β-半乳糖苷酶基因表達(dá)量與發(fā)酵初期相比，上升了1倍左右(P<0.05)；同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過(guò)程中，突變菌株的變化曲線一直高于出發(fā)菌株。這種結(jié)果與之前測(cè)定的酶活力呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系，并與滴定酸度的結(jié)果保持一致。

圖5 菌株β-半乳糖苷酶基因相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Gene expression changes of β-galactose glucoside enzyme by real-time PCR

3 結(jié)束語(yǔ)

本文將篩選獲得的突變菌株A-4-2進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、生長(zhǎng)曲線的測(cè)定、耐酸性、耐膽鹽能力、胞外多糖含量以及表面疏水性的研究，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)革蘭氏染色、電子顯微鏡觀察以及透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)與出發(fā)菌株相比突變菌株在形態(tài)學(xué)上沒(méi)有明顯變化；經(jīng)航天誘變后的高產(chǎn)酸菌株耐膽鹽、產(chǎn)胞外多糖能力均與野生株無(wú)顯著差異，誘變菌株產(chǎn)酸能力及β-半乳糖苷酶基因表達(dá)量升高，通過(guò)進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性和基因表達(dá)量的測(cè)定，探究產(chǎn)酸提高的原因。研究結(jié)果有效證明了β-半乳糖苷酶活性與產(chǎn)酸有密不可分的關(guān)系，為菌株的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。