江 洪 王小紅

1.杭州市第一人民醫(yī)院，浙江杭州 310006；2.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江杭州 310022

目前腫瘤的常規(guī)治療方法為手術(shù)切除、放療和化療，盡管取得了一些進(jìn)展，但諸如肺癌等治療效果不佳，而且腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是困擾臨床腫瘤治療的普遍難題，究其原因，在于現(xiàn)有治療的目標(biāo)仍然集中在腫瘤細(xì)胞本身，而忽略了其微環(huán)境的重要性。腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞之間是“土壤與種子”的關(guān)系，腫瘤惡變過(guò)程，就是腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境共進(jìn)化的過(guò)程，其結(jié)果就是腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，接觸腫瘤微環(huán)境中的免疫負(fù)調(diào)控狀態(tài)，成為腫瘤治療的新策略。

髓樣抑制性細(xì)胞（myeloid derived suppressor cells， MDSC）誘導(dǎo)的免疫抑制是導(dǎo)致免疫治療失敗的重要原因。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在荷瘤小鼠或者腫瘤患者的主要免疫器官內(nèi)存在大量的免疫抑制細(xì)胞。這群細(xì)胞伴隨著腫瘤的生長(zhǎng)在腫瘤部位、血液、外周淋巴器官以及骨髓中逐漸聚集。它們主要是處于不同分化階段的骨髓來(lái)源的細(xì)胞，如未成熟的巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞以及骨髓前體細(xì)胞，它們往往共同表達(dá)CD11b和Gr1標(biāo)志，通過(guò)抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的功能以及促進(jìn)腫瘤血管的新生來(lái)發(fā)揮作用，被稱(chēng)為髓樣抑制性細(xì)胞或骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞（myeloid derived suppressor cells， MDSC）[1-4]。研究表明MDSC主要通過(guò)抑制CD4+、CD8+T細(xì)胞的功能和促進(jìn)腫瘤新血管形成而發(fā)揮作用[5-6]。

誘導(dǎo)MDSC成熟分化有助于腫瘤排斥。目前嘗試用來(lái)清除MDSC或阻斷其功能的方法很多，但效果并不十分理想。其中包括抗體介導(dǎo)的細(xì)胞清除、促進(jìn)MDSC分化成熟和選擇性阻斷MDSC發(fā)揮功能的分子途徑等[7-9]。Suzuki等[10]用Gemcitabine選擇性減少荷瘤鼠的脾臟MDSC，增強(qiáng)了小鼠的抗腫瘤免疫反應(yīng)，小鼠腫瘤發(fā)生率下降。Kusmartsev等[11]使用ARTA在體內(nèi)促進(jìn)荷瘤鼠MDSC分化為成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞 （DC）、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞，增強(qiáng)CD4和CD8介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，延長(zhǎng)腫瘤疫苗作用時(shí)間。De Santo等[12]對(duì)能影響MDSC精氨酸代謝但毒性較小的Nitro aspirin進(jìn)行了Ⅰ/Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)，顯示它具有一定的應(yīng)用前景。然而，因?yàn)檫@些藥物或抑制劑有較大的副作用，限制了其在患者體內(nèi)的應(yīng)用。此外，有研究嘗試用抗小鼠Gr1單克隆抗體RB6-8c5清除荷瘤小鼠體內(nèi)的Gr1陽(yáng)性細(xì)胞，也能取得一定抗腫瘤效果。但是這種方法也存在不足，因?yàn)槌齅DSC以外的大量嗜中性粒細(xì)胞也表達(dá)Gr1，體內(nèi)去除嗜中性粒細(xì)胞后宿主容易并發(fā)感染；并且非連續(xù)性應(yīng)用單克隆抗體容易導(dǎo)致MDSC數(shù)量反彈?？傊?，目前仍無(wú)有效的方法來(lái)消除MDSC的免疫抑制功能進(jìn)而用于腫瘤治療。

真菌多糖具有誘導(dǎo)MDSC成熟分化的潛質(zhì)。已有的研究結(jié)果顯示[13]，分離自香菇的多糖MPSSS對(duì)MDSC具有良好的促分化作用，可有效降低荷瘤小鼠MDSC在脾細(xì)胞中的比例，促進(jìn)其成熟分化為M1型巨噬細(xì)胞，并可以逆轉(zhuǎn)MDSC對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖的抑制作用。分離自莪術(shù)及雪菊的多糖也有類(lèi)似恢復(fù)T細(xì)胞增殖的效應(yīng)[14-15]。

本課題組前期發(fā)現(xiàn)竹蓀多糖具有體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)，而靶向MDSC已成為新的腫瘤治療策略，因此擬從微環(huán)境的角度，研究竹蓀多糖對(duì)MDSC的效應(yīng)及分子機(jī)制。本研究的開(kāi)展將為竹蓀多糖在腫瘤治療中的應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

竹蓀粗多糖購(gòu)自杭州眾芝康菇生物科技有限公司。CD11b抗體、Gr1抗體、Ly6C抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。新生小牛血清（NCS）購(gòu)自杭州四季青公司。胎牛血清（FBS）購(gòu)自德國(guó)PAN公司。鏈霉素、青霉素（100U/ml）購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司。紅細(xì)胞裂解液（RLB）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。流式細(xì)胞分析儀（FACSCalibur，美國(guó)BD公司）、流式細(xì)胞分選儀（FACSAria，美國(guó)BD公司）、電熱恒溫干燥箱（天津泰斯特公司）、酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、顯微鏡（CKX41，日本奧林巴斯公司）、4℃離心機(jī)及吊籃式離心機(jī)（美國(guó)Beckman）、高速低溫離心機(jī)Thermo Micro21R（美國(guó)hermo公司）、超純水制備系統(tǒng)（美國(guó)Millipore）、超凈工作臺(tái)（哈東聯(lián)）、傅里葉變換紅外光譜Vector 33型（德國(guó) Bruck 公司），C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠采購(gòu)自北京維特利華公司。

1.2 竹蓀粗多糖的制備

實(shí)驗(yàn)原材料竹蓀粗多糖由杭州眾芝康菇生物科技有限公司提取，具體方法如下：取1kg竹蓀，加入水10L，沸水提取，時(shí)間2h。加熱濃縮至小體積，對(duì)流動(dòng)水透析48h，透析內(nèi)液濃縮后離心，1∶1加入30%的三氯乙酸溶液，在4℃條件下反應(yīng)4h，加10% NaOH溶液中和至pH 7左右，扎袋對(duì)流動(dòng)水透析48h，透析內(nèi)液濃縮后離心，上清液加入3倍體積的無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜。離心收集沉淀，于40℃干燥，得粗多糖。

1.3 竹蓀多糖的提純

竹蓀粗多糖溶于水中，用15%乙醇再次醇沉，10000rpm離心5min，取上清，放入烘箱中烘干，得到15%醇沉的竹蓀多糖上清干燥物，命名為DP15。

1.4 竹蓀多糖的光譜掃描

紅外光譜法是真菌多糖鑒定初級(jí)結(jié)構(gòu)中常用的工具，用于分析多糖的糖環(huán)構(gòu)想和糖苷鍵的類(lèi)型。稱(chēng)取2mg竹蓀多糖 DP15，與適量的KBr粉末混合，研磨均勻后進(jìn)行壓片。將制好的壓片放入紅外光譜儀內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描區(qū)間為400～4000cm-1，用 Nexus 系統(tǒng)軟件對(duì)采集到紅外吸收?qǐng)D譜進(jìn)行分析。

1.5 竹蓀多糖對(duì)肺癌荷瘤小鼠的抗腫瘤作用的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)

1.5.1 肺癌荷瘤小鼠模型構(gòu)建 路易斯肺癌細(xì)胞系LLC皮下接種于C57BL/6小鼠皮下，接種密度均為1×106/只，構(gòu)建移植瘤模型。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)杭州市第一人民醫(yī)院生物安全與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.5.2 竹蓀多糖DP15作用于LLC荷瘤小鼠的生存率的觀察實(shí)驗(yàn) 將構(gòu)建好的LLC荷瘤小鼠模型進(jìn)行處理，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組10只小鼠，對(duì)照組18只小鼠；實(shí)驗(yàn)組腹腔注射DP15（25mg/kg），每3天一次；對(duì)照組腹腔注射1640+/+培養(yǎng)液（25mg/kg）；定期查看荷瘤小鼠的生存情況，觀察時(shí)間為41d。

1.5.3 竹蓀多糖DP15作用于LLC荷瘤小鼠的腫瘤體積的觀察實(shí)驗(yàn) 將構(gòu)建好的LLC荷瘤小鼠模型進(jìn)行處理，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只小鼠；實(shí)驗(yàn)組腹腔注射DP15（25mg/kg），每3天一次，對(duì)照組腹腔注射1640+/+培養(yǎng)液（25mg/kg）；定期測(cè)量荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況，觀察時(shí)間為25d；腫瘤體積（mm3）計(jì)算公式為：長(zhǎng)×寬×高。

1.5.4 LLC荷瘤小鼠的脾細(xì)胞懸液的制備 LLC荷瘤小鼠制備21d后，深度麻醉處死小鼠；取小鼠脾臟在PBS緩沖液中進(jìn)行研磨，經(jīng)100目濾網(wǎng)過(guò)濾后離心（1500r/min）3min，去上清；加入紅細(xì)胞裂解液（RLB）裂解1min，加入5mL PBS重懸，過(guò)濾后離心（1500r/min）3min，去上清；加入1640+/+培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞板計(jì)數(shù)得到細(xì)胞液濃度，加入1640+/+培養(yǎng)基調(diào)至所需終濃度，得到脾臟單細(xì)胞懸液。

1.5.5 光鏡下直接觀察竹蓀多糖DP15作用于LLC荷瘤小鼠脾細(xì)胞的形態(tài)變化 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的LLC荷瘤小鼠的脾細(xì)胞懸液，以4×106個(gè)細(xì)胞/孔，接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)基為1640+/+；實(shí)驗(yàn)組加入1.2mL的125μg/mL的竹蓀多糖DP15，對(duì)照組加入等量的1640+/+，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天后更換一次培養(yǎng)基；10d后光鏡下觀察LLC荷瘤小鼠脾細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.5.6 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)竹蓀多糖DP15作用于LLC荷瘤小鼠的脾細(xì)胞的MDSC的比例變化 接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，抗體為Gr1、CD11b，竹蓀多糖DP15的濃度為0.1mg/mL。

1.5.7 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)不同濃度的竹蓀多糖DP15作用于LLC荷瘤小鼠的脾細(xì)胞的MDSC的亞群比例變化 脾細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種密度為2×106/孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，抗體為CD11b、Ly6C，竹蓀多糖DP15的濃度分別為125，250和500μg/mL。

1.6 竹蓀多糖作用于MDSC的信號(hào)通路研究

LLC荷瘤小鼠的脾細(xì)胞懸液，經(jīng)流式細(xì)胞分選儀分選出CD11b和Gr1雙陽(yáng)性細(xì)胞，按1×106個(gè)細(xì)胞/孔，接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)基為1640+/+；實(shí)驗(yàn)組加入1.2mL的不同濃度的竹蓀多糖DP15（125μg/mL，250μg/mL和500μg/mL），檢測(cè)P53基因和Bcl-2的表達(dá)變化；還觀察了固定濃度（125μg/mL）DP15作用下，不同時(shí)間點(diǎn)（16h，24h和48h）P53基因表達(dá)的變化。對(duì)照組加入等量的1640+/+，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

MDSC細(xì)胞經(jīng)過(guò)竹蓀多糖DP15做上述處理后，用RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，置冰中40min后，先各取1μL蛋白待測(cè)，再加入4×Loading Buffer，100℃加熱10min后放入-80℃冷藏。將待測(cè)蛋白稀釋至50μL，并配置BSA及AB液，60℃放置15min后用酶標(biāo)儀測(cè)量562nm處吸光值。測(cè)得數(shù)值代入公式計(jì)算蛋白上樣量。配置10%和12% SDS-PAGE（聚丙烯酰胺）凝膠電泳分離膠，電泳分離，80V恒壓電泳至溴酚藍(lán)跑出。取出膠體轉(zhuǎn)膜，100V恒壓電泳70min后將膠轉(zhuǎn)得膜中目標(biāo)蛋白相應(yīng)位置所在條帶剪下。用3% BSA封閉1h后，分別按比例配置、加入目標(biāo)蛋白的相關(guān)一抗4℃孵育過(guò)夜，80min后洗5×5min，再加入目標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)二抗。60min后洗5×5min，取出條帶，加入顯影液后置于曝光儀中進(jìn)行曝光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 竹蓀多糖的紅外光譜分析

竹蓀多糖DP15的光譜掃描結(jié)果顯示在3600～3200cm-1之間的吸收峰，主要是由多糖羥基的伸縮振動(dòng)引起的，2800cm-1附近的吸收峰是C-H伸縮振動(dòng)引起的，1600cm-1附近的吸收峰可能是因?yàn)樗拇嬖冢?000cm-1附近的吸收峰是由于吡喃環(huán)中的伸縮振動(dòng)引起的，800cm-1附近的吸收峰表明 β-葡萄吡喃糖存在。見(jiàn)圖1。

圖1 竹蓀多糖DP15的紅外掃描結(jié)果

2.2 體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組竹蓀多糖DP15作用于LLC荷瘤小鼠的生存時(shí)間較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖2A。竹蓀多糖DP15作用于LLC荷瘤小鼠的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2B。

2.3 竹蓀多糖作用下脾細(xì)胞的形態(tài)

光鏡下直接觀察竹蓀多糖DP15作用于LLC荷瘤小鼠脾細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)果顯示DP15可誘導(dǎo)荷瘤小鼠脾臟貼壁細(xì)胞發(fā)生分支狀改變，而對(duì)照組貼壁細(xì)胞呈圓形。見(jiàn)圖3。

圖2 竹蓀多糖DP15組和對(duì)照組作用于LLC荷瘤小鼠的生存率及腫瘤體積的變化

圖3 竹蓀多糖DP15體外誘導(dǎo)荷瘤小鼠脾臟貼壁細(xì)胞發(fā)生分支狀改變

2.4 竹蓀多糖作用后MDSC比例

流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)竹蓀多糖DP15作用于LLC荷瘤小鼠的脾細(xì)胞的MDSC的比例變化，結(jié)果顯示DP15可顯著下調(diào)CD11b+Gr1+細(xì)胞比例（DP15組與對(duì)照組為：44% vs 77%）。見(jiàn)圖4。

2.5 竹蓀多糖作用后MDSC亞群

圖4 竹蓀多糖DP15明顯下調(diào)體外培養(yǎng)荷瘤小鼠脾細(xì)胞中CD11b+Gr1+細(xì)胞的比例

流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)不同濃度竹蓀多糖DP15作用于LLC荷瘤小鼠的脾細(xì)胞的MDSC的比例變化，結(jié)果顯示DP15可顯著影響多個(gè)細(xì)胞亞群的比例，其中CD11b-亞群比例下降，CD11b+Ly6Chigh和CD11b+LY6Cint亞群比例上升，且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。見(jiàn)圖5。

圖5 竹蓀多糖DP15誘導(dǎo)荷瘤小鼠MDSC亞群分化

2.6 信號(hào)通路研究

竹蓀多糖DP15通過(guò)上調(diào)P53基因表達(dá)水平及下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)水平促進(jìn)MDSC發(fā)生凋亡（圖6）。

圖6 竹蓀多糖DP15可上調(diào)LLC荷瘤小鼠脾臟中MDSC的P53基因表達(dá)水平及下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)水平

3 討論

單純依靠化療藥物殺傷癌細(xì)胞具有很大的局限性，也容易導(dǎo)致正常細(xì)胞的損傷，依靠生物活性因子激活免疫細(xì)胞，通過(guò)免疫細(xì)胞殺傷癌細(xì)胞造成的免疫殺傷是治療癌癥的發(fā)展方向，因此抗腫瘤活性因子及新型藥物具有迫切的技術(shù)市場(chǎng)需求。

MDSC主要是處于不同分化階段的骨髓來(lái)源的細(xì)胞，如未成熟的巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞以及骨髓前體細(xì)胞，它們往往共同表達(dá)CD11b 和Gr1 標(biāo)志，主要通過(guò)抑制CD4+、CD8+T細(xì)胞的功能和促進(jìn)腫瘤新生血管形成而發(fā)揮作用。誘導(dǎo)MDSC的成熟分化有助于抑制腫瘤生長(zhǎng)[16]。

竹蓀中活性的成分較多，多糖是其中具有較高活性的一種大分子物質(zhì)，目前研究發(fā)現(xiàn)竹蓀多糖具有抗腫瘤作用[17-19]。Ukai等[20]研究發(fā)現(xiàn)竹蓀多糖T-4-N（相對(duì)分子質(zhì)量5.5×106）、T-5-N（相對(duì)分子質(zhì)量5.5×106）在小鼠體內(nèi)5mg/kg用量下即可抑制S180皮下移植瘤的生長(zhǎng)（抑制率為58%）；Zhong等[21]發(fā)現(xiàn)竹蓀多糖PDI（相對(duì)分子質(zhì)量6.5×104）在體外直接抑制S180細(xì)胞生長(zhǎng)，用5mg/mL處理S180細(xì)胞72h后，對(duì)S180抑制率為13.9%，并誘導(dǎo)其凋亡增加及阻滯細(xì)胞周期有關(guān)，該效應(yīng)與凋亡相關(guān)基因 Bcl-2、Bax、P53 及細(xì)胞周期蛋白 Cy-clin D、CDK4 相關(guān)；Deng等[22]發(fā)現(xiàn)竹蓀多糖PD3（相對(duì)分子質(zhì)量5×105）可在體內(nèi)抑制S180細(xì)胞生長(zhǎng)，但在體外模型中對(duì)S180沒(méi)有抑制作用，該研究推測(cè)PD3 不是依靠細(xì)胞毒性殺傷腫瘤細(xì)胞，而是激活了機(jī)體免疫細(xì)胞，從而發(fā)揮間接殺傷腫瘤的作用，研究 RPD3 抑制 S180 的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn) RPD3 抑瘤效應(yīng)更強(qiáng)，RPD3 是 PD3 經(jīng) NaOH 處理后變性再透析脫堿復(fù)性的產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)分析顯示 RPD3的糖鏈結(jié)構(gòu)更松散，研究者推測(cè)這種結(jié)構(gòu)變化有利于暴露出更多的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，從而更多的結(jié)合免疫細(xì)胞表面的相應(yīng)受體，刺激細(xì)胞增殖； Liao等[23]通過(guò)研究竹蓀多糖與鋅的螯合物DP1-Zn，發(fā)現(xiàn)其濃度增加至250μg/mL時(shí)劑量依賴性的顯著抑制人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)，雖然對(duì)于人類(lèi)正常細(xì)胞，此濃度的DP1-Zn會(huì)引起一定程度的細(xì)胞凋亡，但是相比于它對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性還是安全的，基于上述結(jié)果，MCF-7細(xì)胞可以作為靶細(xì)胞系進(jìn)一步評(píng)估DP1-Zn的抗腫瘤活性。

本研究結(jié)果顯示DP15可顯著下調(diào)CD11b+和Gr1+細(xì)胞比例，DP15對(duì)MDSC多個(gè)亞群的效應(yīng)存在差異。進(jìn)一步運(yùn)用Western Blot檢測(cè)其相關(guān)的凋亡基因如P53和Bcl-2，發(fā)現(xiàn)P53表達(dá)上調(diào)而B(niǎo)cl-2表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明DP15是通過(guò)誘導(dǎo)MDSC凋亡而下調(diào)其比例。后續(xù)將檢測(cè)竹蓀多糖刺激MDSC后信號(hào)通路蛋白因子如STAT1，STAT3，STAT6的變化及重要的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的變化進(jìn)一步研究其分子機(jī)制。

4 結(jié)論

DP15通過(guò)誘導(dǎo)MDSC凋亡從而下調(diào)MDSC比例，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。