尚雪嬌，王玉榮，楊 江，折米娜，趙慧君，郭 壯，2*

（1.湖北文理學院 食品科學技術(shù)學院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.恩施市公共檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000）

梅干菜又稱梅菜，是以雪里蕻、芥菜或油菜為主要原料，經(jīng)挑選、去根、清洗、除水、腌制和干制等傳統(tǒng)工藝制作而成的特色發(fā)酵蔬菜[1]。采用傳統(tǒng)方法生產(chǎn)梅干菜時，制作環(huán)境相對開放，使得梅干菜中的微生物豐富且多樣。然而，目前對梅干菜的研究多集中于風味物質(zhì)和微量元素測定[2-3]、抑菌和抗氧化能力分析[4-5]以及工藝優(yōu)化[6-7]等方面，有關(guān)其中微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的研究鮮見報道。

由于某些微生物的特殊生長需求及培養(yǎng)條件的限制，基于純培養(yǎng)的傳統(tǒng)微生物學手段只能將樣品中少于1%的微生物分離出來，而非培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)對于這個問題的解決提供了很好的幫助[8]。近年來，以Illumina MiSeq為代表的高通量測序技術(shù)發(fā)展迅速，為分析生境菌群多樣性提供了有力手段，該技術(shù)無需對樣品中微生物進行分離純化，可直接對樣本基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）進行分析，能夠快速、直接和真實的反映菌群物種豐度及差異[9-10]。

本研究采用Illumina MiSeq技術(shù)對采自恩施地區(qū)的梅干菜樣品中細菌多樣性進行解析，同時采用傳統(tǒng)微生物學手段對其中所含乳酸菌進行分離鑒定，以期為恩施地區(qū)梅干菜中微生物菌種資源的發(fā)掘與保護提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

梅干菜MGC01、MGC02和MGC03：主要原料為雪里蕻。于2017年12月采自湖北省恩施地區(qū)土橋壩菜市場。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、碳酸鈣、過氧化氫、三氯甲烷、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、乙酸鈣、十二烷基硫酸鈉、酚、氯仿、異戊醇、溴化十六烷基三甲銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）和醋酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；MRS培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；Axygen清潔試劑盒：北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；10×PCR Buffer、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）mix、DNA聚合酶（5 U/μL）、溶菌酶（400 U/μg）、蛋白酶K（20 U/μg）、pMD18-T vector、Solution I：寶生物工程（大連）有限公司；6×Loading buffer、DL500和DL2000 DNA Marker：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；2×PCRmix：南京諾唯贊生物科技有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit提取試劑盒：德國QIAGEN公司；引物均由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成，各引物信息如表1所示。

表1 實驗所用引物序列信息Table 1 Sequences information of primers used in the study

1.2 儀器與設(shè)備

HR40-IIB2生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；VeritiTM 96孔梯度聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain re action，PCR）擴增儀：美國AB公司；DYY-12水平電泳儀：北京市六一儀器廠；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；LRH-70生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；DG250厭氧工作站：英國DWS公司；5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；ECLIPSE Ci生物顯微鏡：日本Nikon公司；UV PCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國BIORAD公司。

1.3 方法

1.3.1 宏基因組DNA提取

參照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit提取試劑盒中的方法提取梅干菜樣品宏基因組DNA，并用微量紫外分光光度計檢測DNA純度及濃度。

1.3.2 基于MiSeq高通量測序技術(shù)梅干菜細菌多樣性的評價

細菌16S rRNA擴增及測序：以微生物宏基因組DNA為模板進行PCR擴增。擴增體系[14]為5×FastPfu Buffer 4μL、2.5 mmol/LdNTPmix 2μL、5μmol/L的正/反引物（338F/806R）各0.8 μL、5 U/μL r Taq酶 0.4 μL、DNA模板 10 ng，雙蒸水（ddH2O）補充至20μL。PCR擴增條件為95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共循環(huán)30次；72℃再延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

質(zhì)量控制：對測回的序列進行拼接，拼接時去除重疊區(qū)域堿基數(shù)＞10 bp、最大錯配率＞0.2和樣品特異性條形碼（barcode）或引物堿基錯配的序列，拼接后依據(jù)barcode信息將序列劃分至各樣品中以備后續(xù)分析[15]。

數(shù)據(jù)分析：使用QIIME數(shù)據(jù)分析平臺，參照CAPORASO J G等[16]的方法對質(zhì)控后的序列進行分析。首先以97%相似度劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[17]，然后利用Greengenes[18]和RDP[19]數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，統(tǒng)計各分類水平上細菌多樣性。

1.3.3 梅干菜中乳酸菌菌株的分離鑒定

乳酸菌分離純化：采用稀釋涂布平板法將樣品稀釋液涂布于含1.0%～1.2%碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后挑選周圍有透明圈的單菌落進行純化，將革蘭氏染色陽性和過氧化氫酶陰性的純種菌株用30%的甘油進行菌種保藏。

乳酸菌DNA提取與鑒定：采用CTAB法[20]提取純化菌株的DNA，然后以提取的DNA為模板進行PCR擴增，除PCR擴增所需引物為27F和1495R外，PCR擴增體系和條件均與1.3.2相同。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、清潔后與PMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（Escherichia coli）Top10，挑取陽性克隆子送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。將測序公司返回的序列進行拼接并去除正反引物后置于美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上進行同源性比對，選取同源性較高的菌株，使用Mega 7.0中的鄰接（Neighbor-Joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用折線圖評判本研究測序深度是否合適，使用維恩（Venn）圖顯示不同樣品中共有或特有的OTU及序列數(shù)，使用柱狀圖展示不同樣品中各門和屬水平細菌種類和含量，使用系統(tǒng)發(fā)育樹展現(xiàn)不同菌株間進化關(guān)系。折線圖和柱狀圖使用Origin2017軟件繪制。Venn圖由Venny2.1.0在線繪制，系統(tǒng)發(fā)育樹由Mega 7.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)梅干菜細菌多樣性的評價

高通量測序技術(shù)具有通量高、檢測速度快等優(yōu)點，可更加準確、真實的反映樣本中微生物群落結(jié)構(gòu)的組成。因此，首先使用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對干梅菜樣品中細菌在門、綱、目、科和屬各水平上的分類數(shù)量進行統(tǒng)計，然后利用超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)對其物種豐度和多樣性進行分析，結(jié)果如表2所示。

表2 梅干菜樣品測序結(jié)果及各分類地位數(shù)量Table 2 Sequencing results and numbers at different taxonomical levels of preserved vegetable samples

由表2可知，梅干菜樣品MGC01、MGC02和MGC03經(jīng)質(zhì)控合格后的序列分別為25 534條、27 773條和36 858條，在97%的相似度下劃分的OTU數(shù)分別為3 545個、2 528個和4 689個。當測序量為23 610條時，梅干菜樣品MGC01、MGC02和MGC03的超1指數(shù)分別為1 860、1 613和2 362，香農(nóng)指數(shù)分別為7.02、5.79和7.73，其中梅干菜樣品MGC03的超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)值均最大，因而梅干菜樣品MGC03中細菌豐度和多樣性均高于梅干菜樣品MGC01和MGC02。進一步對測序深度是否能捕獲細菌多樣性信息進行了分析，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，當序列數(shù)達到30 000條時，稀疏曲線隨序列數(shù)的增加而增加，而香農(nóng)指數(shù)曲線在序列數(shù)＞10 000條時就已經(jīng)進入平臺期，說明隨著測序深度的增加可能還會有新的物種被發(fā)現(xiàn)但樣品中微生物多樣性不會再增加。由此可見，本研究的測序深度足以滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析要求。本研究進一步對各梅干菜樣品特有及樣品間共有的OTU數(shù)及序列數(shù)進行分析，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，梅干菜樣品MGC01、MGC02和MGC03中特有的OTU分別為2 442個、1 464個和3 565個，所包含序列數(shù)分別為3 982條、2 305條和9 698條。梅干菜樣品MGC01和MGC02共有OTU數(shù)為294個，梅干菜樣品MGC02和MGC03共有OTU數(shù)為315個，梅干菜樣品MGC01和MGC03共有OTU數(shù)為354個；3個梅干菜樣品共有OTU數(shù)為455個，其所包含的序列為61 568條，占總序列數(shù)的68.28%。由此可見，恩施地區(qū)梅干菜樣品中含有豐富的細菌物種且各樣品間存在大量共有細菌菌群。

圖1 稀疏曲線（A）和香農(nóng)指數(shù)曲線（B）Fig.1 Rarefaction curves(A)and Shannon index curves(B)

圖2 梅干菜樣品OTU數(shù)及序列數(shù)的維恩圖Fig.2 Venn diagram of the OTU and sequence number in preserved vegetable samples

梅干菜樣品MGC01、MGC02和MGC03中所含細菌門的數(shù)量分別為13個、9個和10個，包含細菌屬的數(shù)量分別為186個、149個和148個，本研究將相對豐度＞1.0%的細菌門和屬定義為優(yōu)勢細菌門和屬，并對其平均相對含量進行分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 梅干菜樣品中優(yōu)勢細菌門（A）和屬（B）的相對含量分析Fig.3 Relative content analysis of dominant bacterial phyla(A)and genus(B)in preserved vegetable samples

由圖3可知，恩施地區(qū)梅干菜樣品中的優(yōu)勢細菌門為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），其平均相對含量分別為60.70%、23.28%、11.16%、2.76%；優(yōu)勢細菌屬主要為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）和棒狀桿菌屬（Corynebacterium），其平均相對含量分別為60.50%、8.69%、2.86%、1.73%、1.28%、1.07%、1.03%和1.00%。值得一提的是，仍有7.40%的序列不能鑒定到屬水平，這進一步說明恩施地區(qū)梅干菜樣品中細菌多樣性較高。

2.2 梅干菜中乳酸菌菌株的分離鑒定

在使用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)解析發(fā)現(xiàn)梅干菜中的細菌主要以乳酸菌為主的基礎(chǔ)上，本研究進一步采用傳統(tǒng)微生物學手段從3個梅干菜樣品中分離得到12株疑似乳酸菌，編號分別為MGC01-1、MGC01-2、MGC01-3、MGC01-4、MGC02-1、MGC02-2、MGC02-3、MGC02-4、MGC03-1、MGC03-2、MGC03-3和MGC03-4，疑似乳酸菌與其近源種模式株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示。

由圖4可知，菌株MGC03-3、MGC01-3、MGC01-4、MGC02-1、MGC02-2、MGC02-3和MGC02-4與Lactobacillus plantarum NBRC 15891在同一個進化分枝上，親緣關(guān)系較近，故將其判定為植物乳桿菌（L.plantarum），同理，將菌株MGC03-1鑒定為副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei），菌株MGC01-1鑒定為融合魏斯氏菌（Weissella confusa），菌株MGC03-2鑒定為食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius），菌株MGC01-2和MGC03-4鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

圖4 梅干菜中乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria in preserved vegetable samples

3 結(jié)論

本研究通過Illumina MiSeq高通量測序和傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)對恩施地區(qū)梅干菜中細菌多樣性進行了解析，Illumina MiSeq高通量測序結(jié)果表明，恩施地區(qū)梅干菜樣品中的優(yōu)勢細菌門分別為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），優(yōu)勢細菌屬主要為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）和棒狀桿菌屬（Corynebacterium）。經(jīng)稀釋涂布平板法從梅干菜樣品中共分離到12株乳酸菌，包括植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）7株、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）2株、副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei）、融合魏斯氏菌（Weissella confusa）和食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）各1株。