余晨，熊希倩，詹江華，胡曉麗，高偉

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是嚴(yán)重威脅嬰幼兒生命的膽道梗阻性疾病。目前認(rèn)為該病主要由炎癥引起，可導(dǎo)致繼發(fā)性的肝內(nèi)外膽道梗阻、纖維化，繼而形成肝衰，但其確切的病理生理學(xué)機(jī)制尚未完全明確［1］。膽道閉鎖Kasai手術(shù)旨在解除膽道梗阻、重建肝外膽道、開放膽汁引流，但術(shù)后難以避免的進(jìn)展性肝纖維化及肝硬化是制約自體肝生存時(shí)間的關(guān)鍵因素，仍困擾著大多數(shù)研究者［2］。

肝臟纖維化的主要特征為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成大于降解，致使其沉積過多［3］。通過對組織沉積物的研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）家族在ECM的降解過程中占據(jù)主要地位，是影響肝纖維化的重要因素［4］。此前已有學(xué)者關(guān)注MMPs與BA肝纖維化之間的聯(lián)系，但大多數(shù)對于MMPs的研究主要集中于MMP-2、MMP-3、MMP-9等物質(zhì)，且多數(shù)都強(qiáng)調(diào)其在血清中的表達(dá)，而對于MMP-7的了解卻知之甚少［5-7］。最新的一項(xiàng)研究證實(shí)，MMP-7的表達(dá)對于診斷BA及預(yù)測Kasai術(shù)后肝纖維化程度具有高度的特異性［8］。基于上述原因，本文擬從肝臟移植時(shí)獲取的BA患兒病肝組織出發(fā)，并對比Kasai術(shù)時(shí)的肝活檢組織，應(yīng)用免疫組化手段檢測MMP-7蛋白在Kasai術(shù)時(shí)及Kasai術(shù)后不同時(shí)間段患兒肝組織中的表達(dá)情況，同時(shí)研究其與肝纖維化程度、膽管反應(yīng)之間的關(guān)系，探索BA患兒肝臟進(jìn)行性纖維化的原因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取天津市兒童醫(yī)院2017年6月—2018年4月收集到膽道閉鎖患兒行Kasai手術(shù)時(shí)的肝活檢組織共計(jì)15例（Kasai組，即G1組），其中男7例，女8例；同時(shí)收集2015年1月—2016年1月在天津市第一中心醫(yī)院因Kasai術(shù)后肝功能衰竭而行肝移植病肝組織共計(jì)41例（移植組），其中男17例，女24例，患兒均為出生后3個(gè)月內(nèi)行Kasai手術(shù)，平均手術(shù)日齡為（59.18±14.52）d，后因肝臟功能衰竭而行肝移植手術(shù)。肝移植標(biāo)準(zhǔn)［9］：（1）終末期肝病診斷明確，伴有肝硬化的并發(fā)癥（腹水、腦病、消化道出血等）。（2）生長發(fā)育障礙。（3）反復(fù)膽管炎發(fā)作，嚴(yán)重影響患兒生活質(zhì)量。將移植組按患兒行Kasai手術(shù)與肝移植手術(shù)的間隔時(shí)間分為2組：G2組28例，間隔時(shí)間＜2年；G3組13例，間隔時(shí)間≥2年。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.2 研究方法

1.2.1 組織處理 肝組織標(biāo)本均取自術(shù)中肝右葉前緣組織，10%福爾馬林固定、石蠟包埋后，將蠟塊標(biāo)本連續(xù)4μm切片，用于HE染色及免疫組化染色（CK-19、MMP-7抗體及染色工作液均購自北京中杉金橋生物科技有限公司）。

1.2.2 HE染色 病理切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水洗后，蘇木素浸5 min，酸化伊紅乙醇液浸染2 min，再經(jīng)梯度乙醇脫水，透明劑浸泡至透明，中性樹膠封片等操作，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織纖維化程度。

1.2.3 免疫組化染色 病理切片經(jīng)脫蠟至水，放置于枸櫞酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)15 min，冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗5 min×3次，于3%H2O2中37℃孵育10 min，再用PBS沖洗5 min×3次，分別滴加一抗（MMP-7、CK-19），放置于4℃冰箱中過夜；次日取出后置于室溫，PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗，于37℃下孵育30 min，再經(jīng)PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色5～10 min，充分水洗，蘇木素液染核，脫水、透明、中性樹膠封片，于鏡下觀察陽性細(xì)胞種類及表達(dá)情況。

免疫組化陽性標(biāo)準(zhǔn)。（1）定性分析：根據(jù)染色強(qiáng)度分為無棕黃色（陰性）、淡棕黃色（弱陽性）、棕黃色（陽性）、棕褐色（強(qiáng)陽性）。（2）半定量分析：每張切片取5個(gè)不同視野100倍顯微鏡下圖片，經(jīng)IPP（Image-Pro Plus 5.0）圖像分析系統(tǒng)測定CK-19、MMP-7蛋白的平均光密度值（AOD=肝組織陽性細(xì)胞光密度總和/陽性面積），代表其相對表達(dá)量。

1.3 肝纖維化分級標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)Ohkuma'S分級標(biāo)準(zhǔn)［10］將肝臟組織纖維化程度分為Ⅰ～Ⅳ級：Ⅰ級，肝門管區(qū)輕度纖維化；Ⅱ級，臨近門管區(qū)輕度橋連接纖維化；Ⅲ級，伸向臨近門管區(qū)重度橋連接纖維化；Ⅳ級，肝硬化，假小葉形成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni法；非正態(tài)性分布的計(jì)量資料采用M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，多重比較用Bonferroni法。相關(guān)性分析采用Pearson或Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 MMP-7蛋白主要表達(dá)于膽管上皮細(xì)胞、增生的膽管及匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞。G1組肝細(xì)胞呈陽性表達(dá)，膽管細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度較弱（圖1A）。在移植組，膽管細(xì)胞及肝細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度增加，且膽管細(xì)胞比肝細(xì)胞表達(dá)更為強(qiáng)烈（圖1C、E）。CK-19在膽管細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，G2組表達(dá)強(qiáng)度高于其他2組（圖1B、D、F）。

Fig.1 The immunohistochemical staining result of MMP-7 and CK-19 in the three groups圖1 3組MMP-7和CK-19免疫組化染色結(jié)果

2.2 半定量分析結(jié)果 3組患兒肝組織內(nèi)MMP-7和CK-19蛋白表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較發(fā)現(xiàn)G2組MMP-7和CK-19蛋白表達(dá)量明顯高于其余2組（P＜0.05），G1組與G3組上述蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

Tab.1 Comparison of MMP-7 and CK-19 protein expression levels in liver between three groups表1 3組患兒肝組織內(nèi)MMP-7、CK-19蛋白表達(dá)水平比較（AOD，±s）

Tab.1 Comparison of MMP-7 and CK-19 protein expression levels in liver between three groups表1 3組患兒肝組織內(nèi)MMP-7、CK-19蛋白表達(dá)水平比較（AOD，±s）

＊＊P＜0.01；a與G1組比較，b與G2組比較，P＜0.05

組別G1組G2組G3組F n 15 28 13 MMP-7 0.068±0.017 0.093±0.017a 0.084±0.016b 10.541＊＊CK-19 0.119±0.036 0.157±0.040a 0.110±0.044b 7.296＊＊

2.3 相關(guān)性分析 G1～G3組的纖維化程度分別為：2（2，3）vs.4（3，4）vs.4（2，4），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=17.785，P＜0.01）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，G2組纖維化程度明顯高于其余2組（P＜0.017）。將MMP-7的表達(dá)量與肝纖維化程度進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，兩者呈弱正相關(guān)（rs=0.369，P=0.018），隨著肝纖維化程度加重，MMP-7的表達(dá)水平升高，但MMP-7與膽管反應(yīng)程度（CK-19）無明顯相關(guān)性（rs=0.031，P=0.856）。

3 討論

不同于普通肝臟疾病較為緩慢的纖維化進(jìn)程，膽道閉鎖肝纖維化進(jìn)展迅速，是眾多因素參與的復(fù)雜過程，包括肝星形細(xì)胞（HSC）活化、相關(guān)因子的過表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)化（Extracellular matrix transformation，EMT）等。致病因素如病毒感染、膽閉素［11］等造成的肝臟損傷和炎癥，在多種炎性因子的參與下，可激活肝星形細(xì)胞，合成、分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，并產(chǎn)生抑制基質(zhì)降解的因子，導(dǎo)致肝纖維化甚至是肝硬化。目前研究發(fā)現(xiàn)多條促纖維化信號通路參與該過程：包括TGF-β/Smad、Notch、Rho/ROCK、MAPK和P13K信號通路等［12］。MMP-7作為多條促纖維化信號通路的調(diào)節(jié)蛋白及產(chǎn)物，同時(shí)也是各類炎癥因子（如IL-17可通過調(diào)節(jié)MMP-7的活性而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT過程［13］）作用于肝臟的調(diào)節(jié)因子，其與膽道閉鎖肝纖維化之間的相互作用需加以重視。

3.1 MMP-7在膽道閉鎖患兒中的表達(dá) 研究證實(shí)，通過對肝纖維化患者進(jìn)行細(xì)胞因子、趨化因子在內(nèi)的120種血清分析物和蛋白酶檢測后發(fā)現(xiàn)，與肝臟無病變的對照組相比，有17種分析物表達(dá)呈現(xiàn)明顯的差異，其中差異最大且最具有影響力的為MMP-7，提示MMP-7有可能參與了肝臟纖維化過程［14］。臺灣的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示：在BA患兒中檢測出MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-13等的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與同年齡無肝膽疾病的患兒相比，僅MMP-2及MMP-7的表達(dá)量增高，且MMP-7的表達(dá)是MMP-2的4倍以上，故MMP-7可能是MMPs家族中參與膽道閉鎖進(jìn)行性肝纖維化及組織重塑的主要因子。此外，研究者運(yùn)用原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，MMP-7主要表達(dá)于膽管上皮細(xì)胞及肝細(xì)胞［15］。本研究同樣也觀察到病肝組織的膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞均有MMP-7的沉積，說明在這些部位存在局部MMP-7酶原的活化，表明MMP-7參與了BA肝纖維化過程。

國內(nèi)有學(xué)者應(yīng)用人類膽道閉鎖肝臟組織的基因組芯片研究發(fā)現(xiàn)，MMPs家族多個(gè)成員表達(dá)顯著異常，包括MMP-7表達(dá)上調(diào)和MMP-19表達(dá)下調(diào)［16］。此外，Kerola等［17］通過對Kasai術(shù)后自體肝生存的膽道閉鎖患兒進(jìn)行血清學(xué)檢驗(yàn)及組織活檢發(fā)現(xiàn)，MMP-7在基因和蛋白水平均表達(dá)升高，且與纖維化程度呈正相關(guān)，可作為預(yù)后的一個(gè)重要標(biāo)志。同時(shí)，動物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)經(jīng)恒河猴輪狀病毒感染后的大鼠體內(nèi)可檢測到高于未感染大鼠近4倍MMP-7 mRNA的高表達(dá)，且肝纖維化不同階段MMP-7表達(dá)量不同，在進(jìn)展期肝纖維化中MMP-7的表達(dá)顯著增高［18］，因此提出可將MMP-7作為進(jìn)展期肝纖維化及晚期肝纖維化的重要指標(biāo)。筆者的研究同樣也證實(shí)，隨著肝纖維化程度加重，MMP-7表達(dá)量增強(qiáng)，對于纖維化程度較重的移植組，MMP-7蛋白在表達(dá)量及表達(dá)強(qiáng)度上均高于行Kasai手術(shù)時(shí)的表達(dá)。

3.2 MMP-7表達(dá)升高的可能原因 MMPs在肝纖維化過程中的作用存在相互矛盾的兩方面：一方面通過降解正常的肝基底膜成份和促進(jìn)HSC增生，啟動并加重肝纖維化進(jìn)程，另一方面又可清除部分變性的ECM，從而減緩肝纖維化進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)，對于Kasai術(shù)后很快進(jìn)展成肝硬化門脈高壓而行肝移植手術(shù)的膽道閉鎖患兒，其肝組織中MMP-7表達(dá)水平明顯高于自體肝生存時(shí)間長的患兒。分析其可能的原因主要有以下幾點(diǎn)：（1）TGF-β蛋白在肝纖維化早期（即Kasai手術(shù)時(shí)）的表達(dá)量明顯高于肝纖維化后期（肝移植時(shí)）［19］。在肝纖維化早期，TGF-β可激活HSC合成大量的膠原，促進(jìn)纖溶酶原活化抑制因子及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）的合成，抑制MMPs的合成，從而進(jìn)一步擴(kuò)大形成纖維化；同時(shí)HSC又可分泌大量的TGF-β，這種自分泌的正反饋機(jī)制，使得TGF-β加強(qiáng)肝星狀細(xì)胞合成膠原的作用更加明顯。而在肝纖維化后期，TGF-β表達(dá)量降低，抑制MMP-7表達(dá)的作用減弱，從而導(dǎo)致MMP-7表達(dá)增強(qiáng)。（2）肝臟可通過內(nèi)平衡機(jī)制來誘導(dǎo)MMP-7的表達(dá)，即在肝纖維化的進(jìn)程中，隨著Ⅳ型膠原的過度沉積，反饋性地使MMP-7的表達(dá)增加。（3）Kasai術(shù)后肝臟未能完全解除膽道梗阻及開放膽汁引流，致使淤滯的膽汁持續(xù)作用于肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞，從而誘導(dǎo)MMP-7的合成及活化，加速肝纖維化過程。

3.3 MMP-7表達(dá)與膽管增生的關(guān)系 以往的研究表明，炎癥、感染等因素可使膽管上皮細(xì)胞大量增生，增生膽管可通過EMT機(jī)制轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生膠原成分的間充質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了纖維化的進(jìn)程，可能是導(dǎo)致BA纖維化的重要機(jī)制［20］。有文獻(xiàn)報(bào)道稱，MMP-7的表達(dá)量與Kasai術(shù)后膽管增生程度呈正相關(guān)（r=0.454，P=0.023）［17］。在本組實(shí)驗(yàn)中，雖然能夠觀察到隨著纖維化加重，膽管細(xì)胞表達(dá)MMP-7蛋白的強(qiáng)度增加，但并未發(fā)現(xiàn)兩者呈明顯相關(guān)性，可能與本組樣本例數(shù)較少有關(guān)。

綜上，MMP-7蛋白表達(dá)隨肝纖維化程度加重而增強(qiáng)，在BA自體肝生存時(shí)間短的患兒中的表達(dá)高于Kasai術(shù)時(shí)及Kasai術(shù)后自體肝生存時(shí)間長的患兒，表明其對BA患兒肝纖維化進(jìn)展具有促進(jìn)作用，不利于膽道閉鎖患兒Kasai術(shù)后自體肝生存。MMP-7可作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，以期能夠抑制纖維化，從而達(dá)到延長自體肝生存的目的。