皮聞森，劉家明，黃山虎，劉志禮

骨肉瘤（OS）是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，多發(fā)于兒童和青少年。雖然新輔助化療的出現(xiàn)使得原發(fā)患者的生存率有所提高（55%～80%），但發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移的患者5年生存率仍低于20%，其中肺轉(zhuǎn)移是OS患者的主要死亡原因［1］。因此，闡明OS轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，可為OS轉(zhuǎn)移的防治提供有效的策略甚至靶點(diǎn)，對(duì)提高患者生存率非常必要。激光激酶-B（Aurora-B，又稱AURKB），是一種在多種惡性腫瘤中高表達(dá)的癌基因，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［2］。本研究采用骨肉瘤143B、U2-OS細(xì)胞株，結(jié)合生物信息學(xué)探討沉默Aurora-B介導(dǎo)NPM1蛋白磷酸化水平改變對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移、侵襲和增殖能力的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人骨肉瘤細(xì)胞143B購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，Aurora-B沉默慢病毒（LV/ShAurora-B）、NPM1過(guò)表達(dá)慢病毒（LV/NPM1）和陰性對(duì)照慢病毒（LV/negative）購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。總蛋白提取試劑盒（BB-3101）購(gòu)自BestBio公司。凝膠制備試劑盒（AR018）購(gòu)自于BOSTER公司。Aurora-B、NPM1（nucleophosmin1）和磷酸化NPM1ser125單克隆抗體（兔抗人）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。β-actin單克隆抗體（鼠抗人）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔多克隆抗體和HRP標(biāo)記山羊抗鼠多克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 通過(guò)癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cancergenome.nih.gov/）查找NPM1在肉瘤中的表達(dá)水平以及預(yù)后情況；通過(guò)KinasePhos數(shù)據(jù)庫(kù)（http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/）預(yù)測(cè)NPM1的磷酸化情況，預(yù)測(cè)AURKB與NPM1之間的關(guān)系。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染 人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞和143B細(xì)胞株用含15%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分為L(zhǎng)V/ShAurora-B組、NC（LV/negative）組、LV/ShAurora-B與LV/NPM1共轉(zhuǎn)染組。依據(jù)吉?jiǎng)P公司提供的轉(zhuǎn)染指南，分別轉(zhuǎn)染143B與U2-OS細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h以后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Western blot檢測(cè)Aurora-B、NPM1和pNPM1ser125蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染后消化、收集Lv/ShAurora-B組和NC組的細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白后應(yīng)用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白含量。SDSPAGE分離蛋白，于冰上濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜后置于含5%BSA的TBST中封閉2 h，加入Aurora-B（1∶5 000），NPM1（1∶2 000），磷酸化NPM1ser125（1∶2 000）和β-actin（1∶2 000）一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST振蕩洗膜10 min×3次，以封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次。于暗室中加入ECL顯色液曝光，采用Image J進(jìn)行灰度分析。

1.2.4 Wound healing法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化，以5×105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，500μL/孔，常規(guī)孵育，直至細(xì)胞鋪滿，形成細(xì)胞單層。用200μL/移液器槍頭沿培養(yǎng)板底部呈“一”字型劃痕單層培養(yǎng)細(xì)胞，顯微鏡下（×200）觀察初始劃痕區(qū)并照相。吸取原有培養(yǎng)液，PBS清洗2次，去除被刮除的懸浮細(xì)胞，更換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h并拍照（×200）。Image J 1.47 H軟件計(jì)算細(xì)胞遷徙率［遷移率=（0 h的平均寬度-24 h的平均寬度）/0 h的平均寬度］。實(shí)驗(yàn)平行做3次。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將轉(zhuǎn)染后的U2-OS和143B細(xì)胞（3 000個(gè)/孔）分別接種在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。48 h后每孔加入10μL的CCK-8溶液，并在37℃下再溫育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)量在450 nm處光密度（OD）值。實(shí)驗(yàn)平行做3次。

1.2.6 Transwell invasion法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將轉(zhuǎn)染48 h的各組U2-OS、143B細(xì)胞消化，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，分別取150μL細(xì)胞懸液接種于小室內(nèi)，將小室放入含10%FBS的培養(yǎng)液（600μL/孔）中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室，吸棄上室液體，PBS漂洗2次，95%乙醇固定10 min，用棉簽擦凈小室膜上側(cè)未遷移的細(xì)胞。4 g/L結(jié)晶紫染色20 min，PBS漂洗2次。倒置顯微鏡下（×200）隨機(jī)讀取10個(gè)視野，觀察細(xì)胞穿膜情況并拍照。Image J 1.47 H軟件計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)結(jié)果 通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，NPM1在肉瘤中高表達(dá)（圖1A），NPM1高表達(dá)的骨肉瘤患者預(yù)后較差（圖1B）；通過(guò)KinasePhos數(shù)據(jù)庫(kù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，NPM1存在絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（圖1C），而Aurora-B是絲氨酸和蘇氨酸激酶，因此Aurora-B與NPM1之間可能存在相互作用。

2.2 下調(diào)Aurora-B后檢測(cè)Aurora-B、NPM1和pNPM1ser125蛋白的表達(dá)情況 2種細(xì)胞中，與NC組相比，LV/ShAurora-B組Aurora-B和pNPM1ser125蛋白水平降低（P＜0.05），而NPM1蛋白的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、圖2。

Tab.1 Expressions of Aurora-B,NPM1 and pNPM1ser125 detected by Western blot assay表1 Western blot檢測(cè)Aurora-B、NPM1和pNPM1ser125蛋白的表達(dá) （n=3，±s）

Tab.1 Expressions of Aurora-B,NPM1 and pNPM1ser125 detected by Western blot assay表1 Western blot檢測(cè)Aurora-B、NPM1和pNPM1ser125蛋白的表達(dá) （n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別U2-OS細(xì)胞Aurora-B NPM1pNPM1ser125 NC組LV/ShAurora-B組t 0.984±0.077 0.051±0.006 20.924＊＊0.714±0.012 0.750±0.034 1.729 0.624±0.012 0.015±0.001 87.598＊＊組別NC組LV/ShAurora-B組t 143B細(xì)胞Aurora-B 0.874±0.031 0.098±0.013 39.984＊＊NPM1 0.654±0.010 0.678±0.019 1.936 pNPM1ser125 0.651±0.028 0.243±0.012 23.198＊＊

2.3 各組骨肉瘤細(xì)胞的遷移情況比較 LV/ShAurora-B組遷移率均低于NC組（P＜0.05），且共轉(zhuǎn)染組中下調(diào)Aurora-B的遷移抑制被部分恢復(fù)（P＜0.05），見表2。

Fig.1 The results of bioinformatics analysis圖1 生物信息學(xué)分析結(jié)果

Fig.2 Expressions of Aurora-B,NPM1 and pNPM1ser125 detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測(cè)Aurora-B、NPM1和pNPM1ser125蛋白的表達(dá)

Tab.2 The cell migration ability detected by Wound healing assay in OS cells表2 Wound healing實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞的遷徙能力（n=3，%，±s）

Tab.2 The cell migration ability detected by Wound healing assay in OS cells表2 Wound healing實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞的遷徙能力（n=3，%，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與LV/ShAurora-B組比較，P＜0.05；表3、4同

組別NC組LV/ShAurora-B組共轉(zhuǎn)染組F U2-OS細(xì)胞50.7±10.4 20.2±5.6a 35.1±4.7ab 12.983＊＊143B細(xì)胞61.5±12.8 23.0±9.8a 42.5±2.6ab 12.448＊

2.4 各組骨肉瘤細(xì)胞的增殖情況比較 143B和U2-OS細(xì)胞中，LV/ShAurora-B組增殖能力均低于NC組（P＜0.05），且LV/ShAurora-B+LV/NPM1共轉(zhuǎn)染組能部分恢復(fù)下調(diào)Aurora-B的增殖抑制（P＜0.05），見表3。

Tab.3 The proliferation ability detected by CCK-8 assay in OS cells表3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞增殖能力（n=3，OD值，±s）

Tab.3 The proliferation ability detected by CCK-8 assay in OS cells表3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞增殖能力（n=3，OD值，±s）

組別NC組LV/ShAurora-B組共轉(zhuǎn)染組F U2-OS細(xì)胞0.843±0.060 0.413±0.035a 0.633±0.021ab 78.509＊＊143B細(xì)胞1.073±0.076 0.493±0.025a 0.757±0.025ab 106.906＊＊

2.5 各組骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力比較 在2種細(xì)胞中，LV/ShAurora-B組侵襲細(xì)胞數(shù)均低于NC組（P＜0.05），且LV/ShAurora-B+LV/NPM1共轉(zhuǎn)染組能部分恢復(fù)下調(diào)Aurora-B的侵襲能力抑制（P＜0.05），見表4、圖4。

Tab.4 The invasion ability detected by Tanswell invasion assay in OS cells表4 Transwell invasion實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力（n=3，個(gè)/視野，±s）

Tab.4 The invasion ability detected by Tanswell invasion assay in OS cells表4 Transwell invasion實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力（n=3，個(gè)/視野，±s）

組別NC組LV/ShAurora-B組共轉(zhuǎn)染組F U2-OS細(xì)胞155.000±14.526 82.333±22.745a 134.000±11.523a 14.613＊143B細(xì)胞189.330±15.011 57.667±16.010a 120.667±13.051ab 63.997＊＊

Fig.3 The cell migration ability detected by Wound healing assay in OS cells（×200）圖3 Wound healing實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞的遷徙能力（×200）

Fig.4 The cell invasion ability detected by Tanswell invasion assay in OS cells(crystal violet staining,× 200）圖4 Transwell invasion實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×200）

3 討論

Aurora-B是Aurora家族3個(gè)成員之一，其功能是參與調(diào)節(jié)中心體和微管的功能、保證染色體的精確分離和胞漿的有效分離、著絲粒的復(fù)制、雙極紡錘體的形成以及監(jiān)測(cè)紡錘體檢測(cè)點(diǎn)的忠實(shí)性等［3］。它們通常在G2/M期達(dá)到高峰，是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期由G2期向M期進(jìn)展的關(guān)鍵因子。Aurora-B基因定位在17p13，處在易位、缺失或擴(kuò)增活躍的染色體區(qū)段，意味著它們具有天然的不穩(wěn)定性。有研究顯示，Aurora-B通過(guò)激活蛋白激酶B（protein kinase B,AKt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)（mammalian target of rapamycin,mTOR）信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞存活和增殖［4］。本課題組前期研究表明，Aurora-B通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/AKt/核轉(zhuǎn)錄因子kappa β（nuclear factor kappa beta，NF-κβ）信號(hào)通路促進(jìn)骨肉瘤惡性表型［5］。本次研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKt抑制并不能完全逆轉(zhuǎn)Aurora-B介導(dǎo)的骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移，提示Aurora-B所介導(dǎo)的骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移可能還涉及其他分子機(jī)制。因此，進(jìn)一步探討Aurora-B介導(dǎo)骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制顯得十分必要和重要。

NPM1是一種具有高活性的核仁蛋白，在核糖體蛋白組裝、染色質(zhì)重塑以及DNA修復(fù)、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮積極作用［6-8］。磷酸化、乙酰化和泛素化等翻譯后修飾可使生成的NPM1定位于不同的亞細(xì)胞區(qū)域，從而行使不同的功能。越來(lái)越多的證據(jù)表明，NPM1是一種直接參與癌癥發(fā)病機(jī)制的核仁蛋白。在包括前列腺癌、血液腫瘤和高級(jí)漿液性卵巢腺癌等多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)，NPM1的高表達(dá)且與腫瘤進(jìn)展和抗藥性有關(guān)［9］。本研究通過(guò)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)查找，顯示NPM1在肉瘤中高表達(dá)以及NPM1高表達(dá)的患者預(yù)后較差，并且Aurora-B與NPM1之間可能存在磷酸化作用。以此為基礎(chǔ)，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了下調(diào)Aurora-B后磷酸化NPM1ser125蛋白的表達(dá)降低，而非磷酸化NPM1蛋白的表達(dá)不變。以上結(jié)果表明Aurora-B能夠介導(dǎo)NPM1的磷酸化。然而，Aurora-B介導(dǎo)的NPM1蛋白磷酸化并不一定對(duì)骨肉瘤細(xì)胞惡性表型產(chǎn)生效應(yīng)，為此，進(jìn)一步行體外惡性表型的驗(yàn)證顯示，沉默Aurora-B后骨肉瘤的侵襲、增殖和遷移能力均受到抑制，且沉默Aurora-B后同時(shí)過(guò)表達(dá)NPM1發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Aurora-B對(duì)骨肉瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖的抑制作用被部分緩解，這證實(shí)了Aurora-B能夠通過(guò)介導(dǎo)NPM1蛋白磷酸化促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞惡性表型，但是NPM1介導(dǎo)骨肉瘤惡性表型改變的具體分子機(jī)制仍未可知。

Chen等［10］研究顯示，NPM1通過(guò)影響Akt活性，從而在乳腺癌中發(fā)揮抗凋亡作用。另外，研究證實(shí)RNA干擾（RNAi）沉默NPM1基因能顯著降低前列腺癌細(xì)胞中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）的磷酸化水平［11］。ERK1/2的磷酸化可促使與NF-κβ相結(jié)合的Iκβα發(fā)生降解，使定位于胞漿的NF-κβ轉(zhuǎn)移至核內(nèi)［12-13］；NF-κβ的核內(nèi)移位可促使基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloprotein-2，MMP-2）、MMP-9等與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)包括骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤的細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［14-15］。因此，在骨肉瘤細(xì)胞中，Aurora-B是否通過(guò)NPM1/ERK/NF-κβ信號(hào)軸促進(jìn)骨肉瘤惡性表型亦是后續(xù)有意義的研究方向。

綜上所述，Aurora-B通過(guò)介導(dǎo)NPM1蛋白磷酸化促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞惡性表型。但本研究?jī)H做了Aurora-B沉默，且缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一結(jié)論。另外，NPM1介導(dǎo)骨肉瘤惡性表型改變的具體分子機(jī)制亦有待后續(xù)進(jìn)一步研究。