楊志平 ，秦麗媛 ，王玉川 ，陳 林 ，3，4，楊明摯 ，張漢波 ，4**

（1.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091；2.昭通市天麻研究院，云南 昭通 657000；3.云南大學(xué)生態(tài)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091；4.云南大學(xué)省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091）

天麻（Gastrodia elata） 是高度退化的蘭科多年生、腐生草本植物，全株無綠葉，無葉綠素，不能進(jìn)行光合作用，地下有肉質(zhì)塊莖，長扁形，大小不一。其種子如粉塵般細(xì)小，無胚乳和其他營養(yǎng)貯備部位，僅由胚和種皮構(gòu)成，胚組織無器官分化，在沒有可供給種子萌發(fā)的外源營養(yǎng)條件下，其正常發(fā)芽需依靠小菇屬（Mycenasp.）為主要類群的真菌促進(jìn)。目前已經(jīng)確定了部分天麻利用萌發(fā)菌，完成自身萌發(fā)的相關(guān)代謝通路及抗性相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)[1]。天麻種子利用紫萁小菇（M.osmundicola） 獲得養(yǎng)分的方式為種子的原胚體細(xì)胞消化、吸收菌絲使胚體長大突破種皮發(fā)芽[2]。

在實(shí)際的應(yīng)用和研究工作中，小菇屬真菌分離過程中存在一定的困難，除了剛萌發(fā)的原球莖，很難直接判斷其他材料上是否存在萌發(fā)菌，這一問題限制了一些有可能存在萌發(fā)菌的材料的發(fā)掘，進(jìn)而導(dǎo)致某些萌發(fā)菌的物種很難被人們發(fā)現(xiàn)并利用。云南省昭通市一直以來就有麻農(nóng)用蕨草須根來促進(jìn)天麻種子萌發(fā)，但這種方法會(huì)造成很大程度的空塘率。之后麻農(nóng)從山東、北京、陜西等省市引入“兩菌”，部分新的引入種確實(shí)能提高產(chǎn)量，但也存在引入菌種退化、不純等問題，這不僅未能促進(jìn)當(dāng)?shù)靥炻楫a(chǎn)業(yè)的發(fā)展，還帶來眾多問題，例如感染有雜菌、病毒、害蟲的兩菌會(huì)引發(fā)天麻塊莖腐爛病和蟲蝕等。同時(shí)市面上的萌發(fā)菌，大多來源不明確，菌株與大多數(shù)食用菌菌落形態(tài)相似，真假難辨，甚至有不良商家用食用菌充當(dāng)萌發(fā)菌進(jìn)行銷售，造成部分種植戶的重大經(jīng)濟(jì)損失。

因此，快速定位天麻萌發(fā)菌在“環(huán)境”中的存在，對于找到并分離天麻萌發(fā)菌非常有意義。雖然近幾年出現(xiàn)的高通量測序方法也可以快速檢測出樣本中是否存在小菇屬真菌，但此方法用于檢測大量樣本將導(dǎo)致較高的經(jīng)濟(jì)成本和時(shí)間成本。所以本試驗(yàn)根據(jù)MacDonald&Sarre提出的適用于設(shè)計(jì)檢測“環(huán)境DNA”中某種物種的引物的驗(yàn)證框架[3]，并結(jié)合運(yùn)用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的方法[4]，設(shè)計(jì)適用于小菇屬真菌DNA快速檢測的特異性引物。這種用“環(huán)境DNA”樣品檢測目標(biāo)DNA存在的方法提供了一個(gè)定位小菇屬真菌相對簡單、快速而又經(jīng)濟(jì)的方法。為研究、分離更多小菇屬真菌奠定良好的前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究所用的小菇屬真菌菌株（Mycenasp.）BZZ由昭通市天麻研究院提供。用于檢驗(yàn)設(shè)計(jì)引物的特異性試驗(yàn)所用菌株囊括了子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌 （Zygomycota） 門三個(gè)門的黑盤孢科 （Amphisphaeriaceae）、梨孢假殼科 （Apiosporaceae）、葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）、殼斗科 （Capdiaceae）、革蓋菌科（Coriolaceae）、新球腔菌科（Davidiellaceae）、間座殼科（Diaporthaceae）等45個(gè)科，擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）、葡萄座腔菌屬 （Botryosphaeria）、枝孢屬（Cladosporium）、炭疽菌屬（Colletotrichum）、附球（真） 菌屬（Epicoccum）、偽壺?fù)?dān)菌屬（Pseudolagarobasidium）、柄銹菌屬 （Puccinia） 等 125個(gè)屬，合計(jì)125種真菌。

1.1.2 主要試劑和儀器

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：去皮馬鈴薯100 g，切成小塊，加水煮沸30 min，用4層紗布過濾，在濾液中加葡萄糖10 g、瓊脂10 g，加去離子水補(bǔ)足至500 mL。

5×TBE：Tris 堿 54 g、 硼 酸 27.5 g、0.5 mol·L-1EDTA-Na 20 mL，用800 mL無菌去離子水溶解，混勻后加無菌去離子水用容量瓶定容至1 L（pH為8.0）。dNTP Mix（大連 TaKaRa公司），Ex Taq酶（大連TaKaRa公司），DL2000 DNA Marker（大連TaKaRa公司），Golden view核酸染料、TIANGEN TIANamp Soil DNA Kit土壤基因組DNA提取試劑盒、TIANGEN Plant Gemic DNA Kit植物基因組DNA提取試劑盒。

土壤篩、分析天平，Model CPA26P，德國；Gering組織細(xì)胞破碎儀TissuePrep，北京中創(chuàng)先鋒科技有限責(zé)任公司；VeritiTM梯度PCR儀，Applied Biosystems，美國；核酸電泳儀，Bio-Rad，美國；紫外凝膠成像分析系統(tǒng)，Bio-Rad，美國。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

在 NCBI（National Center for Biotechnology Information） 網(wǎng)站上查詢、下載小菇屬和口蘑科（Tricholomataceae）其他屬真菌的部分基因序列，如表1所示。接著將序列導(dǎo)入DNASTAR Lasergene v7.1軟件包中的SeqMan中，然后將所有序列合并為一個(gè)FASTA格式文件。使用軟件Clustal X v2.1將序列文件的多個(gè)序列進(jìn)行兩兩比對構(gòu)建距離矩陣[5]，觀察距離矩陣找出小菇屬序列中一致的，但不同于同科中其他屬真菌序列的區(qū)域，記下位點(diǎn)和此位點(diǎn)的序列區(qū)。使用MrBa v3.2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[6]。使用jModel－Test v2.1.4選擇最適合的核苷酸取代模型[7-8]。結(jié)合找出的位點(diǎn)和區(qū)域，選取與小菇屬真菌相近但與其他屬真菌較遠(yuǎn)的序列，用Primer Premier v5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

表1 設(shè)計(jì)引物用序列信息Tab.1 Information of downloaded sequences from NCBI used for design primers

1.2.2 引物特異性檢測

在進(jìn)行引物驗(yàn)證前，采用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有小菇屬真菌菌株BZ的DNA作為陽性對照測試引物，測試能否成功擴(kuò)增出小菇屬真菌序列。成功擴(kuò)增出小菇屬真菌序列后，采用實(shí)驗(yàn)室其他種屬的真菌DNA驗(yàn)證引物特異性。驗(yàn)證時(shí)首先利用引物合成公司給的退火溫度擴(kuò)增DNA序列。若特異性差（出現(xiàn)非特異性條帶）可適當(dāng)提高退火溫度；若目標(biāo)條帶太暗，可適當(dāng)增加DNA濃度或增加擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)數(shù)；若非特異性條帶出現(xiàn)在100 bp～200 bp區(qū)間，則應(yīng)該考慮降低引物濃度。

1.2.3 引物實(shí)際運(yùn)用靈敏度檢測

在昆明西山森林公園采集林下土壤，采用60目土壤篩過篩后，收集土壤分裝在20支離心管中，每管裝2.5 g，進(jìn)行土壤濕熱滅菌，3次滅菌完成后待用，滅菌條件為121℃，60 min，每次滅菌后取出于室溫放置24 h再進(jìn)行下一次滅菌；在貼有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上接種陽性小菇屬真菌菌株BZZ，待其長滿培養(yǎng)基后，用無菌9 mm菌落打孔器打孔截出圓菌片，再用無菌鑷子將圓菌片取50片置于滅菌且裝有濾紙的培養(yǎng)皿中（在放入圓菌片前先稱量此培養(yǎng)皿重量并記下數(shù)值），裝完后稱量總重量；將單個(gè)圓菌片面積分別為1/8、1/4、1/2和1個(gè)、5個(gè)、10個(gè)圓菌片在無菌操作條件下加入上述準(zhǔn)備好的離心管中，接著將離心管置于快速組織細(xì)胞破碎儀中研磨，直至圓菌片與土壤進(jìn)行充分混勻。接下來，按TIANamp Soil DNA Kit的提取方法進(jìn)行總DNA提??；先用通用引物ITS（ITS4：TCCTCCGCT TATTGATATGC； ITS5： GGAAGTAAAAGTCGTAA CAAGG）[13]擴(kuò)增驗(yàn)證DNA提取質(zhì)量，再用篩選出的特異引物和擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。

引物靈敏度定義為圓菌片質(zhì)量占土壤質(zhì)量的百分比（土壤質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于菌盤重量），其數(shù)值越小，說明該引物靈敏度越高。計(jì)算公式（S，%）為：

注：m1表示圓菌片質(zhì)量（g）；m2表示土壤質(zhì)量（g）。

1.2.4 PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系：10×擴(kuò)增緩沖液5μL，dNTP混合物5μL，正反引物各1μL，DNA模板1μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，加雙蒸水至50μL。擴(kuò)增條件：94℃變性4 min；94℃反應(yīng) 1 min；適當(dāng)退火溫度（X） 反應(yīng)1 min；72℃反應(yīng)1 min，35個(gè)循環(huán)。72℃延伸10 min。其中退火溫度（X）根據(jù)各對引物退火溫度調(diào)整。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測

制備1%的瓊脂糖凝膠。將加熱溶解的膠體稍稍冷卻至50℃～60℃后加入DNA顯色劑（0.05%Golden view）混勻，倒入插好梳子的膠槽，完全冷卻后拔下孔梳，把膠置于盛有1×TBE緩沖液的電泳槽備用。

吸取PCR產(chǎn)物5μL與1μL 6×Loading Buffer混勻后點(diǎn)入點(diǎn)樣孔，以DL2000的DNA Marker為參照，在121 V恒壓下電泳30 min。電泳結(jié)束后，將膠塊在紫外凝膠成像系統(tǒng)中拍照觀察。

1.2.6 實(shí)際檢測能力驗(yàn)證

采用采自昭通小草壩的天麻種子萌發(fā)菌塘土壤和天麻原球莖驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物的實(shí)際檢測能力。將天麻原球菌用無菌水沖洗3次，按照TIANGEN Plant Gemic DNA Kit的方法提取總DNA。采集的土壤經(jīng)60目土壤篩篩選，采用TIANamp Soil DNA Kit提取總DNA。利用篩選出來的引物對這些環(huán)境樣本總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增DNA片段送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，檢驗(yàn)?zāi)芊駨臉颖局锌焖贆z測出小菇屬真菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS基因引物設(shè)計(jì)

共設(shè)計(jì)了5對引物，引物位置見圖1，引物信息見表2。

圖1 設(shè)計(jì)引物位置圖Fig.1 Position diagram of designed primers in this study

2.2 PCR擴(kuò)增陽性驗(yàn)證

PCR擴(kuò)增陽性驗(yàn)證結(jié)果見圖2。

由圖2可知，所有引物都成功擴(kuò)增出實(shí)驗(yàn)室小菇屬真菌BZZ的DNA片段，PCR產(chǎn)物的實(shí)際大小均在設(shè)計(jì)理論片段大小范圍內(nèi)，且測序后比對結(jié)果均為小菇屬真菌，說明所有引物均能擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的小菇屬真菌序列。

2.3 真菌菌株DNA的PCR擴(kuò)增特異性驗(yàn)證

通過分析3個(gè)門、45個(gè)科、125個(gè)屬的125株真菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果可知，M52-1特異性不強(qiáng)，測試菌株均能擴(kuò)增出條帶；M52-2在退火溫度為63℃時(shí)，除陽性外被擴(kuò)增出來的菌株還有肉座菌科（Hypocreaceae） 的臍孢木霉菌（Trichoderma brevicompactum）、Gmoniaceae科的Ophiogmonia apiospora、小叢殼科 （Glomerellaceae） 的小叢殼屬真菌（Glomerellasp.），占到測試菌株的2.4%；M22-3在退火溫度為61℃時(shí)，除陽性外被擴(kuò)增出來的菌株還有新球腔菌科 （Davidiellaceae） 的枝孢菌 （Cladosporiumsp.）、黑盤孢科（Amphisphaeriaceae）的擬盤多毛孢（Pestalotiopsis neglecta）、小雙腔菌科（Didymellaceae） 的巨腔莖點(diǎn)霉（Phoma macrostoma）、小叢殼科 （Glomerellaceae） 的膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、黑腐皮殼科 （Valsaceae）的擬莖點(diǎn)霉（Phomopsissp.）、格孢腔菌科（Pleosporaceae） 的甘蔗雙孔孢菌（Bipolaris sacchari）、炭角菌科（Xylariaceae）的座堅(jiān)殼菌（Roselliniasp.）、叢赤殼科（Nectriaceae）的水生鐮孢（Fusicolla aquaeductuum），占到測試菌株的6.4%；M11-4在退火溫度為58℃時(shí)，除陽性外被擴(kuò)增出來的菌株還有炭角菌科（Xylariaceae） 的中碳?jí)|菌屬菌（Nemaniasp.）、叢赤殼科（Nectriaceae）的瑪利亞霉（Mariannaeasp.）、口蘑科（Tricholomataceae）的杯傘屬菌（Clitocybesp.）、隔孢球殼科（Didymosphaeriaceae） 的Paraphaeosphaeria neglecta、蛇形蟲草科 （Ophiocordycipitaceae） 的Chaupycnissp.，占到測試菌株的4.0%；BZZ-5在退火溫度為63℃時(shí)，除陽性外被擴(kuò)增出來的菌株還有發(fā)菌科（Trichocomaceae）的青霉菌（Penicilliumsp.）、傘形霉科（Umbelopsidaceae）的傘狀霉屬菌（Umbelopsissp.）、莢孢腔菌科 （Sporormiaceae） 的光黑殼屬菌（Preussiasp.）、葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）的小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum）、炭角菌科（Xylariaceae） 的Xylaria venustula、小叢殼科（Glomerellaceae） 的博寧炭疽菌（Colletotrichum boninense）、叢赤殼科 （Nectriaceae） 的燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum）、肉座菌科 （Hypocreaceae）的枝頂孢霉屬菌（Acremoniumsp.）、小叢殼科（Glomerellaceae） 的朱頂紅炭疽菌 （Colletotrichum cliviae），占到測試菌株的7.2%。

表2 設(shè)計(jì)引物信息Tab.2 Information of designed primers in this study

圖2 PCR擴(kuò)增陽性驗(yàn)證膠圖Fig.2 Electrophoretic gel for PCR amplification as positive control

2.4 土壤中的小姑屬真菌DNA擴(kuò)增靈敏度驗(yàn)證

土壤中的小姑屬真菌DNA擴(kuò)增靈敏度驗(yàn)證結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 各個(gè)濃度土壤總DNA經(jīng)ITS引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物膠圖Fig.3 Electrophoretic gel for PCR amplification of different concentrations of Mycena sp.DNA in soil by ITSprimer

由圖3和圖4的引物ITS4和ITS5檢驗(yàn)可知，試驗(yàn)成功提取了按比例加過菌絲的土壤總DNA，目標(biāo)片段出現(xiàn)在750 bp指示帶附近，符合理論長度即700 bp左右，如圖3所示。用特異性良好的4對引物，即M22-3、BZZ-5、M52-2和M11-4，進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證后，結(jié)果如圖4所示。通過膠圖，可以看出M22-3、BZZ-5靈敏度較好，在測試范圍內(nèi)能檢測到的菌絲最小濃度為0.033%，而根據(jù)其條帶的亮度，M22-3靈敏度最好；M52-2、M11-4靈敏度相較于其他兩對較差，在測試范圍內(nèi)能檢測到的最小濃度為1.292%。

2.5 實(shí)際土壤環(huán)境和生物組織檢測能力驗(yàn)證

用4對均成功來自天麻原球莖和天麻種子萌發(fā)菌塘土壤樣本的引物的總DNA擴(kuò)增出相應(yīng)片段，大部分片段測序峰圖良好，少數(shù)幾條片段為雙重峰。擴(kuò)增片段經(jīng)過序列測定，在NCBI上經(jīng)BLAST比對，發(fā)現(xiàn)特異DNA片段序列與分離自日本的日本赤箭（Gastrodia nipponica）的小菇屬真菌菌株序列（Gen－Bank accession number：LC013373） 相似度都達(dá)到了99%。結(jié)果表明引物M22-3、BZZ-5、M52-2和M11-4都能夠從環(huán)境樣本DNA中快速檢測出小菇屬真菌，但M52-2和M11-4的DNA擴(kuò)增片段測序時(shí)部分樣本會(huì)出現(xiàn)雜峰。

圖4 四對引物靈敏度檢測膠圖Fig.4 Electrophoretic gel of four pairs prumers.in the test of primer sensitivity

3 討論

1980年徐錦堂和冉硯珠[14]從天麻種子發(fā)芽的原球莖中首次分離出與天麻種子具有共生作用的“京陜807-02號(hào)”，該菌株后來被鑒定為紫萁小菇[15]。隨后陸續(xù)有一些新的萌發(fā)菌的相關(guān)報(bào)道，如蘭小菇（M.orchidicola）、石斛小菇（M.dendrobii）、開唇蘭小菇（M.aectochili）等[16]。盡管汪鋆植等[17]發(fā)現(xiàn)來自白栓菌屬的大白栓菌（Trametes laclinea） 為一種新的萌發(fā)菌；Liu等[18]表明來自其他4個(gè)屬的真菌，包括毛殼菌屬 （Chaetomium）、瘤菌根菌屬 （Epulorhiza）、頭孢霉屬（Cephalosporium）、角菌根菌屬（Ceratorhiza）也可以促進(jìn)天麻萌發(fā)。但這些菌株主要處于研究階段，并未實(shí)際運(yùn)用到天麻的種植生產(chǎn)中。相對來說，小姑屬真菌仍然是目前最為有效和廣泛地用于人工栽培天麻的萌發(fā)真菌類群[19-20]。利用小菇屬真菌作為萌發(fā)菌，天麻種子發(fā)芽率高、營養(yǎng)繁殖莖和原球莖生長速度快、體積大，接上蜜環(huán)菌的幾率高，天麻產(chǎn)量也高[21]。因此鑒定、篩選出優(yōu)良的小菇屬真菌，對提高天麻有性繁殖產(chǎn)量至關(guān)重要。

本試驗(yàn)針對現(xiàn)階段昭通當(dāng)?shù)氐奶炻榉N植過程中萌發(fā)菌菌種退化、菌種資源單一等問題開展研究。通過對目前已經(jīng)在NCBI登記的小菇屬真菌DNA序列的歸納、總結(jié)，在ITS序列區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)并得到了4對小菇屬真菌特異性良好的引物（M52-2、M22-3、M11-4和BZZ-5），均可以成功擴(kuò)增出小菇屬真菌。然而，設(shè)計(jì)引物時(shí)未能夠找到完全擴(kuò)增不出其他屬真菌的引物，某些被擴(kuò)增出的其他屬真菌在分離測序菌株中的占比分別為木霉屬（Trichodermasp.）0.8%、枝孢屬（Cladosporiumsp.）0.8%、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsissp.）5.3%、炭疽菌屬（Colletotrichumsp.）0.8%、碳?jí)|菌屬（Nemaniasp.）1.5%、瑪利亞霉（Mariannaeasp.）3.0%、青霉菌（Penicilliumsp.）3.0%、傘狀霉屬（Umbelopsissp.）0.8%、鐮刀菌屬（Fusariumsp.）13.5%。不過，在測試菌株內(nèi)檢測引物特異性時(shí)，4對引物能擴(kuò)增出來的其他屬真菌幾乎不重疊，故在實(shí)際運(yùn)用時(shí)可采用2對到多對引物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增；當(dāng)采用土壤作為檢測的“環(huán)境”樣本進(jìn)行引物靈敏度檢測時(shí)，土壤中含有0.033%的菌絲體濃度時(shí)即可成功檢測出小菇屬真菌的存在；同時(shí)，用天麻萌發(fā)初期組織和菌塘土壤樣本總DNA檢測了引物在實(shí)際生產(chǎn)中運(yùn)用能力，有4對引物都可以檢測出小菇屬真菌的分布?？傮w來看，本文設(shè)計(jì)獲取的M22-3和BZZ-5兩對引物對小菇屬真菌的特異性、靈敏度都較高，經(jīng)過組合應(yīng)用，能夠達(dá)到快速篩選出小菇屬真菌的目的，并可用于對環(huán)境材料中小菇屬真菌的快速定位。

除天麻外，大多數(shù)蘭科植物的種子萌發(fā)和幼苗生長也依賴小菇屬M(fèi)ycenasp.等真菌營養(yǎng)[22-23]。本研究利用設(shè)計(jì)的ITS引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增快速篩選天麻萌發(fā)真菌的結(jié)果，也可為其他蘭科植物種子萌發(fā)真菌的篩選提供借鑒，從而促進(jìn)蘭科植物種苗快繁途徑中有性繁殖技術(shù)的發(fā)展。