李 臻，王少杰，劉國立，簡 瑞

0引言

息肉狀脈絡(luò)膜血管病變(polypoidal choroidal vasculopathy，PCV)屬于臨床常見視網(wǎng)膜病變，調(diào)查顯示在亞洲PCV發(fā)病率為60%～90%，患者多出現(xiàn)滲出型視網(wǎng)膜脫離及視網(wǎng)膜出血，嚴重者導致視力損害[1]。PCV發(fā)病原因及危險因素目前尚不明確，多數(shù)研究認為PCV是環(huán)境、遺傳、生物因素相互作用的結(jié)果[2]。近期研究證實，病理性血管形成是導致PCV發(fā)生的直接原因，在受到外界刺激后內(nèi)皮細胞過度增殖，導致新生血管形成[3]。研究證實白介素-8(interleukin-8，IL-8)為血管生成因子，且其受體CXCR1、CXCR2也參與血管形成，三者在內(nèi)皮細胞生長中發(fā)揮重要作用[4]。然而IL-8是否參與PCV的發(fā)生，目前尚不明確。因此本研究通過檢測PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2水平，以明確其在PCV發(fā)生中的作用。

1對象和方法

1.1對象選擇2016-04/2018-03在本院進行治療的PCV患者67例作為研究對象，其中男45例，女22例；左眼32眼，右眼35眼；年齡45～84(平均60.84±6.14)歲；病程1～24(平均10.36±2.48)mo；單息肉37例，多息肉30例。納入標準：(1)視網(wǎng)膜出現(xiàn)紅色、橘黃色結(jié)節(jié)病灶；(2)吲哚菁綠血管造影(indocyanine green angiography，ICGA)檢測黃斑區(qū)發(fā)現(xiàn)典型息肉病灶，且伴脈絡(luò)膜血管網(wǎng)；(3)光相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)檢測顯示漿液性出血性視網(wǎng)膜色素上皮層脫離。排除標準：(1)青光眼、白內(nèi)障、視網(wǎng)膜病變、角膜病變者；(2)病理性近視、年齡相關(guān)性黃斑變性等脈絡(luò)膜新生血管疾病者；(3)近期內(nèi)接受抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、光動力療法及手術(shù)治療者；(4)心、肝、腎臟等嚴重受損者。另選取同期在本院進行治療的50例白內(nèi)障患者作為對照組，其中男32例，女18例；年齡39～80(平均60.57±6.14)歲；排除合并青光眼、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜疾病者。兩組研究對象的年齡、性別構(gòu)成比等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準同意，研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1樣本采集PCV組患者在進行玻璃體腔注射前抽取房水150μL；對照組患者在進行白內(nèi)障手術(shù)治療前抽取房水150μL，所有樣品均保存在-80℃冰箱中備用。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測房水中IL-8、CXCR1、CXCR2表達參照RNA提取試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific)說明書提取房水總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用Primer3軟件設(shè)計熒光定量PCR引物，見表1。反應體系(20μL)：2×SYBR Mix 10μL，10倍稀釋cDNA 1μL，上下游引物各0.5μL，H2O 8μL。每個樣品設(shè)置3個重復孔。在Rotor-Gene3000 real-time PCR儀(德國QIAGEN公司，型號：Rotor-Gene Q)上進行反應，程序設(shè)定為：95℃ 預變性10s，95℃ 10s，62℃ 20s，72℃ 2min，共35個循環(huán)。反應結(jié)束后保存數(shù)據(jù)，利用儀器自帶軟件分析數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt法計算IL-8、CXCR1、CXCR2 mRNA相對表達量。

1.2.3最佳矯正視力和中心凹視網(wǎng)膜厚度檢測所有患者入院后均采用國際標準視力表測量最佳矯正視力(best corrected visual acuity，BCVA)，并換算為LogMAR視力。

表1引物序列

基因引物序列(5-3)IL-8ForwardATGACTTCCAAGCTGGCCGTGReverseCTCTTCAAAAACTTCTCCCXCR1ForwardGAGGTTGTGTGTGGAAGGTGReverseAGGTTGATGTTTTGGCAGTGCXCR2ForwardTGGGCAACAATACAGCAAACTReverseGCACTTAGGCAGGAGGTCTTAβ-actinForwardTCCTCCCTGGAGAAGAGCTAReverseTCAGGAGGAGCAATGATCTTG

組別IL-8CXCR1CXCR2PCV組1.25±0.061.46±0.041.33±0.09對照組0.57±0.130.42±0.110.48±0.12t37.79871.40543.798P<0.001<0.001<0.001

注：對照組：白內(nèi)障患者。

采用OCT掃描儀檢測中心凹視網(wǎng)膜厚度(central macular thickness，CMT)，掃描時以中心凹視網(wǎng)膜為主，采用6mm×6mm 3D模式，縱向、橫向分辨率分別為3.87、11.4μm，掃描深度設(shè)定為2mm，記錄CMT，每位患者重復測量3次，取平均值。

2結(jié)果

2.1兩組患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2mRNA水平比較與對照組相比，PCV組患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2 mRNA表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見表2。

2.2兩組患者BCVA和CMT的比較對照組患者BCVA(0.09±0.02)顯著優(yōu)于PCV組(0.19±0.02)，CMT(266.86±20.42μm)顯著低于PCV組(386.15±21.79μm)，差異均有統(tǒng)計學意義(t=26.755、30.085，均P<0.001)。

2.3PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2水平與BCVA、CMT的相關(guān)性分析PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2水平與BCVA(LogMAR)呈正相關(guān)(r=0.438，P<0.01；r=0.346，P=0.013；r=0.385，P=0.002)，與CMT呈正相關(guān)(r=0.378，P=0.005；r=0.606，P<0.01；r=0.357，P=0.011)，見圖1。

2.4影響PCV發(fā)生的多因素分析以PCV發(fā)生作為因變量，將年齡、性別、IL-8等指標作為自變量進行Logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示IL-8、CXCR1、CXCR2、BCVA、CMT是影響PCV發(fā)生的危險因素，見表3。

圖1PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2與BCVA、CMT相關(guān)性分析。

圖2IL-8、CXCR1、CXCR2診斷PCV的ROC曲線。

表3影響PCV發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

變量βSEWald χ2POR95%CI年齡0.1280.2490.2640.1891.1371.106～1.169性別0.1690.1152.1600.0741.1841.059～1.323CMT0.5660.4271.7570.0191.7621.349～2.302BCVA0.6130.4391.949<0.0011.8461.156～2.947IL-80.7830.5262.216<0.0012.0531.687～2.498CXCR10.8510.4094.329<0.0012.3411.368～4.006CXCR20.7970.4321.844<0.0012.2191.336～3.685

2.5IL-8、CXCR1、CXCR2對PCV的診斷價值ROC曲線分析顯示，IL-8、CXCR1、CXCR2對PCV具有一定診斷價值。IL-8診斷PCV的曲線下面積(AUC)為0.882(P<0.01)，敏感性為80.60%，特異性為88.06%；CXCR1診斷PCV的AUC為0.860(P<0.01)，敏感性為76.11%，特異性為83.58%；CXCR2診斷PCV的AUC為0.812(P<0.01)，敏感性為71.64%，特異性為85.07%，見圖2、表4。

3討論

PCV屬于一種特殊眼底疾病，病情嚴重則會影響患者視力，甚至導致失明，近年來我國發(fā)病率逐年升高[5]。PCV發(fā)病機制較復雜，具體機制尚不明確。研究認為，

表4IL-8、CXCR1、CXCR2對PCV的診斷價值

檢測指標AUC標準誤95%CIZPIL-80.8820.0330.847～0.91612.203<0.01CXCR10.8600.0290.809～0.9232.085<0.01CXCR20.8120.0430.746～0.8557.171<0.01

PCV 息肉狀的病灶主要與色素上皮發(fā)生慢性退行性變、炎癥反應有關(guān)，也有研究發(fā)現(xiàn)眼局部的一些細胞因子和趨化因子會在PCV發(fā)病過程中發(fā)生變化[6-7]。趙敏等[8]研究顯示，PCV發(fā)病過程中，外周血中的趨化因子、血管形成因子均發(fā)生異常。IL-8參與血管內(nèi)皮形成、血管炎癥反應，而其是否與PCV有關(guān)，目前未見報道，因此本研究以IL-8為切入點探索PCV的發(fā)病機制，為PCV的治療提供新線索和新靶標。

IL-8屬于趨化因子家族成員，能夠通過不同方式調(diào)控血管形成。研究證實，IL-8與腫瘤轉(zhuǎn)移、血管形成密切相關(guān)[9]。體外研究顯示，無炎癥發(fā)生情況下，內(nèi)皮細胞培養(yǎng)時添加IL-8能夠誘導血管內(nèi)皮細胞發(fā)生增殖及趨化反應[10]。動物實驗研究顯示，IL-8可直接誘導血管形成[11]。另有研究顯示，轉(zhuǎn)染IL-8的腫瘤細胞可迅速生成新生血管[12]。Choi等[13]認為，IL-8為血管形成的重要因子，體外培養(yǎng)微血管內(nèi)皮細胞誘導其凋亡時，添加IL-8后能夠使凋亡細胞數(shù)量明顯減少，此外IL-8能夠刺激內(nèi)皮血管細胞增殖。以上研究均提示IL-8與血管形成、血管病變密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，PCV患者房水中IL-8 mRNA表達明顯升高，表明房水中IL-8的異?？赡芘cPCV有關(guān)。張亞芳等[14]發(fā)現(xiàn)PCV患者血清中IL-8水平與正常者并無明顯差異，這與本研究結(jié)果不一致，分析原因可能為PCV病變后房水中IL-8進入血清后其水平可能受到其他因素影響，因此造成血清IL-8水平無差異。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PCV患者房水中IL-8水平與BCVA(LogMAR)、CMT呈顯著正相關(guān)，說明隨著BCVA(LogMAR)、CMT的升高，IL-8分泌升高，提示IL-8表達與患者視力、視網(wǎng)膜狀況有關(guān)，也可能與PCV的進展有關(guān)。Logistic回歸分析顯示，IL-8為PCV發(fā)生的獨立危險因子。以上結(jié)果提示房水中IL-8參與PCV的發(fā)生，且其表達上調(diào)與視力、視網(wǎng)膜病變程度有關(guān)。

CXCR1、CXCR2基因為CXCR家族中的重要成員，均定位于染色體2q35，在單核細胞、T 淋巴細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞表面表達[15]。CXCR1和CXCR2均為 IL-8 受體，與IL-8都有高度的親和性，IL-8與CXCR1和CXCR2結(jié)合后通過相互作用，調(diào)節(jié)下游信號通路，發(fā)揮生物學功能。CXCR1/2與IL-8結(jié)合被激活使CXCR1/2胞漿區(qū)構(gòu)象改變，隨后G蛋白釋放二磷酸鳥苷(guanosine diphosphate，GDP)結(jié)合三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)，活化效應蛋白催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)產(chǎn)生環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)；活化磷脂酶 C將細胞膜上磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2)水解成肌醇三磷酸(inositol-1，4，5-trisphosphate，IP3)，導致細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活鈣調(diào)蛋白激酶，升高蛋白質(zhì)磷酸化水平，使效應細胞發(fā)生遷移、脫離，分泌活性產(chǎn)物，進而參與機體炎癥、血管形成、腫瘤遷移等生理過程。關(guān)于腸道炎癥疾病的研究發(fā)現(xiàn)，IL-8與CXCR2相互作用，進而促使炎性細胞向腸黏膜轉(zhuǎn)移和浸潤，加速腸道炎癥反應[16]。在腫瘤組織中，IL-8與受體CXCR1、CXCR2結(jié)合后可促使微環(huán)境中血管形成，促進細胞遷移、侵襲，從而促進腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移[17]。癌細胞研究顯示，上調(diào)CXCR1/2可增加癌細胞對IL-8反應性，加速疾病進展[18]。采用CXCR1/2拮抗劑G31P封閉CXCR1/2后，可降低IL-8表達水平，同時降低腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力[19]。研究顯示，CXCR1和CXCR2可在內(nèi)皮細胞表達，且在內(nèi)皮細胞生長、燒傷愈合、血管生成中發(fā)揮重要作用[20]。體外移植實驗顯示，CXCR1和CXCR2可在受損皮膚角質(zhì)層表達，且可通過調(diào)控Th1/Th2調(diào)節(jié)角質(zhì)層細胞的表達[21]。然而二者是否與PCV的發(fā)生有關(guān)，目前尚未有報道。本研究發(fā)現(xiàn)，PCV患者房水中CXCR1和CXCR2 mRNA表達明顯升高，表明房水中IL-8受體CXCR1和CXCR2的異常表達與PCV可能有關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PCV患者房水中CXCR1和CXCR2的表達水平與BCVA(LogMAR)呈正相關(guān)，與CMT呈正相關(guān)，說明隨著BCVA降低、CMT的升高，CXCR1和CXCR2表達逐漸升高，提示患者視力、視網(wǎng)膜狀況能夠影響房水中CXCR1和CXCR2的表達，CXCR1和CXCR2可能與PCV的進展有關(guān)。Logistic回歸分析顯示，CXCR1和CXCR2為PCV發(fā)生的獨立危險因子。以上結(jié)果提示房水中CXCR1和CXCR2參與PCV的發(fā)生，且與病程進展有關(guān)。此外，ROC曲線分析顯示，IL-8、CXCR1、CXCR2診斷PCV的AUC分別0.882、0.860、0.812，提示PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2對PCV診斷均有一定價值，可能是PCV的潛在診斷標志物。

綜上所述，PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2表達上調(diào)可能與PCV的發(fā)生有關(guān)，有望成為PCV早期診斷及治療的潛在靶點和診斷指標。但本研究僅從臨床水平研究IL-8及其受體在PCV診斷中的臨床意義，并未從分子機制上進行深入研究，有待后續(xù)進一步探究。