李偉超,張亭,潘尉,楊建海

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第983醫(yī)院,天津300142)

膿毒癥主要是指由感染因素引發(fā)的一種全身炎癥反應(yīng)綜合征，是臨床上嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、休克患者最為常見的并發(fā)癥之一，如不給予及時(shí)有效治療，隨著病情不斷進(jìn)展會(huì)引發(fā)膿毒癥休克以及多器官功能障礙綜合征，是導(dǎo)致重癥監(jiān)護(hù)病房患者死亡的最主要原因之一[1]。盡管目前我們對(duì)膿毒癥的發(fā)病機(jī)制有了一定的認(rèn)識(shí)，但其病死率仍未得到有效控制[2]。因此，尋找一種可早期診斷膿毒癥的生物標(biāo)記物顯得尤為重要。微小RNA(miRNAs)主要是通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而有效調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝以及分化、增殖、凋亡等過(guò)程，進(jìn)一步在機(jī)體生理病理過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[3]。有研究報(bào)道顯示，miRNAs在膿毒癥患者中存在異常表達(dá)，其可能成為膿毒癥患者早期診斷以及預(yù)后評(píng)估有效指標(biāo)[4]。miRNA-21是微小RNA的一個(gè)重要亞型，其與機(jī)體的炎癥反應(yīng)具有一定關(guān)聯(lián)性。目前，臨床上關(guān)于miRNA-21與膿毒癥關(guān)系的報(bào)道較少。本研究觀察了膿毒癥患者血清miRNA-21水平的變化，并探討了其與病情、預(yù)后的關(guān)系，同時(shí)評(píng)估了其診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月～2018年6月中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第983醫(yī)院收治的膿毒癥患者83例(膿毒癥組)，男52例、女31例，年齡24～71(48.35±10.42)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)[5]:與拯救膿毒癥戰(zhàn)役(SSC)關(guān)于膿毒癥最新診斷標(biāo)準(zhǔn)相符；住院時(shí)間≥5 d；臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):合并心、肝、腎等臟器功能嚴(yán)重障礙者；伴有腦梗死或急性冠脈綜合征者；伴有腫瘤疾病或免疫系統(tǒng)疾病者。

根據(jù)患者病情嚴(yán)重程度:一般膿毒癥[5]50例(無(wú)休克組)、休克性膿毒癥(由膿毒癥導(dǎo)致的低血壓經(jīng)液體復(fù)蘇后收縮壓仍<90 mmHg，需予以升壓藥物維持者)33例(休克組)。另取同期于本院進(jìn)行體檢的健康者50例作為對(duì)照組，其中男32例、女18例，年齡23～73(49.01±10.28)歲。膿毒癥組與對(duì)照組性別、年齡有可比性。

1.2 臨床病情嚴(yán)重程度的評(píng)估 入院24 h內(nèi)采用急性生理功能和慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)Ⅱ(APACHEⅡ)評(píng)分及有無(wú)休克評(píng)估患者的病情嚴(yán)重程度。

1.3 血清miRNA-21檢測(cè) 膿毒癥組分別于入院第1、3、5天，對(duì)照組于入院體檢時(shí)采集外周靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心10 min，取上層血清保存于-80 ℃冰箱中待檢。根據(jù)mir Vana PARIS試劑盒說(shuō)明書提取血清總RNA，并在稀釋后參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其反應(yīng)體系包括RTace 0.5 μL，RT 5×Buffer 4 μL，RNase抑制劑0.5 μL，稀釋后的RNA 12 μL，逆轉(zhuǎn)錄引物RT prime 1 μL，dNTP 2 μL。逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA進(jìn)行稀釋，采用qRT-PCR技術(shù)測(cè)定miRNA-21。miRNA-21上游引物序列:5’-CGGCGGTAGCTTATCAGACTG-3’；下游引物序列:5’-AATGGTTGTTCTCCACACTCTC-3’；以U6為內(nèi)參，上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物:5′-AACGCT-TCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)體系:cDNA 1 μL，DEPC水3 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，SYBR 5 μL。95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用2-ΔΔCt表示血清miRNA-21的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 血清miRNA-21的水平與膿毒癥患者預(yù)后關(guān)系分析 對(duì)所有膿毒癥患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止日2018年7月26日或患者死亡。記錄患者生存情況。按照28 d病死率分為存活組67例與死亡組16例，比較兩組血清miRNA-21水平，以評(píng)估血清miRNA-21水平與預(yù)后的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)血清miRNA-21水平比較 膿毒癥組入院第1、3、5天血清miRNA-21水平分別為(1.97±0.90)、(1.02±0.71)、(0.53±0.31)ng/μL，對(duì)照組為(0.48±0.33)ng/μL。各指標(biāo)組間(F=106.438)、時(shí)間(F=80.932)及交互作用(F=80.932)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與入院第1天比較，膿毒癥組入院第3、5天miRNA-21水平均低(P均<0.05)。入院第1、3天膿毒癥組血清miRNA-21水平均高于對(duì)照組(P均<0.05)。

2.2 休克組與無(wú)休克組血清miRNA-21、APACHEⅡ評(píng)分比較 入院第1天休克組、無(wú)休克組血清miRNA-21水平分別為(2.66±0.48)、(1.27±0.28)ng/μL，APACHEⅡ評(píng)分分別為(31.95±4.87)、(16.32±2.59)分。休克組血清miRNA-21水平及APACHEⅡ評(píng)分均高于無(wú)休克組(t分別為15.106、16.917，P均<0.05)。

2.3 血清miRNA-21檢測(cè)對(duì)膿毒癥的診斷價(jià)值 入院第1天血清miRNA-21診斷膿毒癥的敏感度為73.47%，特異度為38.29%，ROC下面積為0.752(95%CI=0.501～1.003，P=0.008)，第3天血清miRNA-21診斷膿毒癥的敏感度為62.94%，特異度為35.71%，ROC下面積為0.722(95%CI=0.452～0.992，P=0.015)。

2.4 血清miRNA-21水平與膿毒癥患者生存情況的關(guān)系 存活組入院第1、3、5天血清miRNA-21水平分別為(1.65±0.49)、(0.78±0.15)、(0.48±0.13)ng/μL，死亡組分別為(3.03±0.78)、(1.53±0.32)、(1.02±0.09)ng/μL。各指標(biāo)組間(F=404.437)、時(shí)間(F=586.825)及交互作用(F=40.688)比較,P均<0.05。入院第1、3、5天，存活組血清miRNA-21水平均低于死亡組(P均<0.05)。

3 討論

膿毒癥屬于嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染以及休克最為常見的并發(fā)癥之一[6]。在膿毒癥的發(fā)展過(guò)程中，特征性補(bǔ)體系統(tǒng)的激活以及先天免疫系統(tǒng)的過(guò)度活化等因素會(huì)影響巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子、趨化因子等炎性介質(zhì)的反應(yīng)，從而分泌更多的氧自由基等刺激炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步加劇了炎癥反應(yīng)，促使機(jī)體調(diào)控機(jī)制失調(diào)，繼而對(duì)組織器官造成損傷，最終導(dǎo)致機(jī)體膿毒癥休克甚至死亡[7]。由此，盡早地對(duì)膿毒癥進(jìn)行診斷，評(píng)估膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度以及預(yù)后是早期有效控制膿毒癥發(fā)展、降低膿毒癥患者死亡率的重要途徑。既往，臨床上主要是通過(guò)臨床癥狀、體征檢查，血常規(guī)檢查以及病原菌檢查等方式診斷膿毒癥[8，9]。然而，臨床癥狀、體征檢查以及病原菌檢查受主觀性的影響較大，可能導(dǎo)致診斷結(jié)果出現(xiàn)誤差；血常規(guī)檢測(cè)無(wú)法對(duì)膿毒癥進(jìn)行早期診斷，存在一定的局限性。隨著相關(guān)研究的不斷深入，越來(lái)越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在多種炎性狀態(tài)下表達(dá)升高，且在血清中穩(wěn)定存在，這為血清miRNA-21作為膿毒癥的生物標(biāo)記物提供了理論依據(jù)[10]。

miRNA-21屬于miRNAs家族中的一個(gè)亞型，主要位于17q23.2染色體FRA17脆性區(qū)域上，存在高度保守性，在血清等體液中穩(wěn)定存在，在多種炎性狀態(tài)表達(dá)均顯著升高，不但可自己調(diào)控促炎因子以及抑炎因子的表達(dá)，同時(shí)可通過(guò)對(duì)炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路的其他關(guān)鍵分子產(chǎn)生作用，從而可有效反映膿毒癥患者的炎癥狀態(tài)[10]。本研究結(jié)果表明，入院第1、3天膿毒癥組血清miRNA-21水平均高于對(duì)照組，休克組血清miRNA-21、APACHEⅡ評(píng)分均高于無(wú)休克組，提示膿毒癥患者血清miRNA-21水平升高，隨著膿毒癥患者病情的逐漸加重，血清miRNA-21水平逐漸升高，其主要原因可能是因?yàn)槟摱景Y癥狀的加劇導(dǎo)致了患者機(jī)體中的炎癥狀態(tài)更加明顯，進(jìn)而誘發(fā)了血清miRNA-21水平上升，提示血清miRNA-21水平與膿毒癥患者的病情有關(guān)。

本研究中，我們將入院第1、3天的血清miRNA-21檢測(cè)進(jìn)行ROC分析，結(jié)果顯示第1、3天血清miRNA-21診斷膿毒癥的ROC下面積為0.752及0.722，敏感度分別為73.47%、62.94%，，特異度分別為38.29%、35.71%，與劉姿等[11]研究報(bào)道相符，提示其可作為臨床膿毒癥的早期診斷指標(biāo)之一，但其特異度并不是很高。有研究[12，13]報(bào)道，血清miRNA-21在多種腫瘤以及心血管疾病患者中均存在不同程度的異常表達(dá)。因此認(rèn)為，miRNA-21可能并非是膿毒癥的特有指標(biāo)，臨床工作中可通過(guò)聯(lián)合其他標(biāo)志物(如PCT)以及相關(guān)臨床資料進(jìn)行綜合檢測(cè)，從而提高膿毒癥早期診斷的準(zhǔn)確性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，入院第1、3、5天存活組患者血清miRNA-21水平均低于死亡組，提示血清miRNA-21可能與膿毒癥患者的預(yù)后也有關(guān)系，其原因主要是miRNA-21的表達(dá)升高可能對(duì)機(jī)體全身性炎癥反應(yīng)的爆發(fā)產(chǎn)生一定程度的影響，從而導(dǎo)致血清中白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8以及腫瘤壞死因子-α等一系列炎癥因子過(guò)量釋放，進(jìn)一步導(dǎo)致患者病情逐漸惡化，甚至死亡。

綜上所述，膿毒癥患者血清miRNA-21水平升高，其水平變化可反映患者病情嚴(yán)重程度，有助于膿毒癥的早期診斷，且有利于預(yù)后的評(píng)估。需要指出的是，本研究也有一定的不足之處，比如研究樣本量比較少，且隨訪時(shí)間也相對(duì)較短，今后可通過(guò)擴(kuò)大樣本量、并延長(zhǎng)隨訪時(shí)間的方式獲得更加準(zhǔn)確的研究結(jié)果。