陳旖鹛，黃思聰，蔡志濤，李萬根，嘉紅云

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,廣州510260；2東莞康華醫(yī)院)

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥作為全球常見的遺傳性人類酶缺乏病，是引起溶血性疾病的重要原因。當(dāng)G6PD缺乏癥者服用具有氧化作用的藥物或食物時，可引起紅細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽(GSH)嚴(yán)重降低，導(dǎo)致胞膜蛋白氧化損傷而誘發(fā)溶血，嚴(yán)重者可發(fā)生昏迷甚至休克[1]。葛根素注射液由于具有擴(kuò)張冠狀動脈、改善缺血心肌的代謝[2]、降血糖血脂[3]等眾多藥理作用，是目前心血管疾病、2型糖尿病等慢性病患者常用的中成藥注射用制劑[4]。Wang等[5]曾報道多個由葛根素注射劑誘發(fā)的急性溶血案例，但現(xiàn)階段暫時沒有絕對證據(jù)證明葛根素誘發(fā)G6PD缺乏癥溶血的報道，我們在臨床中觀察到兩例糖尿病合并G6PD缺乏者使用含葛根的中藥方劑治療糖尿病時出現(xiàn)嚴(yán)重溶血現(xiàn)象[6,7]，同時有報道[8]稱高濃度的葛根素會通過改變鼠紅細(xì)胞跨膜蛋白而導(dǎo)致溶血的發(fā)生。鑒于此，本研究中我們首先觀察了不同濃度葛根素對G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞溶血率的影響 ，然后用不同濃度H2O2溶液模擬氧化損傷因素誘發(fā)G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞溶血，探討葛根素對G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞溶血率的影響及不同濃度葛根素對紅細(xì)胞H2O2耐受力的影響

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院門診2018年2～10月G6PD缺乏癥患者15例(觀察組)，均符合《第4版臨床檢驗操作規(guī)程》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，男6例、女9例，年齡24～48歲，G6PD活性(0.26±0.08)U/L，血清鐵及總膽紅素正常，總膽固醇2.7～5.0 mmol/L，甘油三酯<143 mg/dL；6例男性血紅蛋白(Hb) 110～156 g/L、MCV 82～96 fL，9例女性Hb 98～124 g/L、MCV 85～92 fL。排除白血病、腫瘤、慢性腎病、SLE、急慢性血管內(nèi)溶血疾病等。另隨機(jī)選取10例G6PD酶活性正常的健康體檢者為對照組，男6例、女4例，年齡23～49歲，G6PD活性(3.95±0.89 )U/L,血清鐵、總膽紅素、膽固醇、甘油三酯、Hb水平均正常。兩組性別、年齡比較，P均>0.05。

1.2 加入不同濃度葛根素注射液后兩組紅細(xì)胞溶血率的檢測 空腹抽取患者肘靜脈血，用0.9%氯化鈉注射液洗滌后，配制成5%的紅細(xì)胞懸液。以加入0.9%氯化鈉注射液的紅細(xì)胞懸液為陰性對照管，以加入蒸餾水的紅細(xì)胞懸液為陽性對照組。在觀察組和對照組紅細(xì)胞懸液中，分別加入濃度為1.15、1.35、1.55、1.75、1.95、2.15、2.35、2.55、2.75、2.95、3.15、3.35 mg/mL的葛根素注射液(新鄉(xiāng)東升制藥有限公司，批號1611/5111)，37 ℃孵育1 h后，1 500 r/min離心10 min，分光光度計在545 nm處測定各管上清液的吸光度(A)值，計算溶血率，溶血率=(A藥物-A陰性對照)/(A陽性對照-A陰性對照)×100%；觀察兩組開始溶血的濃度，開始溶血標(biāo)準(zhǔn)為溶血率大于5%。

1.3 不同濃度葛根素注射液對G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞H2O2耐受力的檢測 取觀察組紅細(xì)胞懸液分別加入加入終濃度為1.15 mg/mL的葛根素注射液(葛根素組)，0.9%氯化鈉注射液(NS組)。兩組分別加入濃度為8.1、9.0、9.9、10.8、11.7、12.6、13.5 mg/mL的H2O2溶液，37 ℃孵育1 h后，1 500 r/min離心10 min，測定溶血率。另取潔凈試管，以8.1 mg/mL的H2O2與觀察組紅細(xì)胞混合誘發(fā)溶血，同時分別加入濃度為0.6、0.75、0.90、1.05、1.20、1.35、1.50 mg/mL的葛根素注射液，37 ℃孵育1 h后，1 500 r/min離心10 min，測定溶血率。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度葛根素注射液加入后兩組紅細(xì)胞溶血率比較 觀察組加入葛根素注射液后，開始溶血時葛根素注射液濃度為(1.48±0.18)mg/mL，低于對照組的(1.69±0.21)mg/mL(t=2.622，P=0.015)。加入1.15、1.35、1.55、1.75、1.95、2.15、2.35、2.55、2.75、2.95、3.15、3.35 mg/mL的葛根素注射液，觀察組的溶血率分別為2.89%、4.74%、7.51%、13.62%、29.67%、49.66%、73.47%、85.70%、89.92%、95.11%、96.40%、96.88%，對照組分別為1.32%、2.12%、5.17%、5.92%、15.97%、21.25%、27.75%、38.70%、57.75%、71.32%、81.97%、88.98%，從加入的葛根素注射液濃度為1.75 mg/mL開始，隨著葛根素的增高，同一葛根素注射液濃度下觀察組溶血率高于對照組(P均<0.05)。

2.2 不同濃度葛根素注射液對G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞H2O2耐受力的影響 葛根素組加入濃度依次為8.1、9.0、9.9、10.8、11.7、12.6、13.5 mg/mL的H2O2溶液后溶血率分別為9.89%、12.49%、17.36%、25.03%、31.62%、42.08%、47.48%，NS組分別為10.43%、12.52%、20.73%、31.70%、44.76%、53.12%、65.33%。從H2O2濃度為9.9 mg/mL開始，隨著H2O2濃度遞增，葛根素組及NS組的溶血率均上升；在同一H2O2濃度下，葛根素組的溶血率均低于NS組(P均<0.05)。H2O2與觀察組紅細(xì)胞混合誘發(fā)溶血，同時加入濃度依次為0.6、0.75、0.90、1.05、1.20、1.35、1.50 mg/mL的葛根素注射液后溶血率分別為6.11%、5.95%、7.28%、11.81%、18.91%、29.48%、40.59%。觀察組中，葛根素注射液濃度在0.6～0.9 mg/mL之間的溶血率比較，P均>0.05，而從葛根素注射液濃度為1.05 mg/mL開始，G6PD缺乏癥的紅細(xì)胞溶血率反而隨葛根素注射液濃度的增高而增高(P均<0.05)。

3 討論

G6PD缺乏癥為X連鎖不完全顯性遺傳病，據(jù)估計目前世界上罹患G6PD缺陷者達(dá)4億多人。G6PD缺陷的基因在我國主要分布于黃河流域以南各省，發(fā)病率為4%～20%。紅細(xì)胞對氧化損傷的耐受能力很大程度上依賴于NAPDH的還原能力，其水平主要由G6PD決定，G6PD酶產(chǎn)生還原代謝物NADPH，具有抗氧化作用。同理，G6PD缺乏癥患者意味著其紅細(xì)胞容易受到氧化損傷的打擊而造成嚴(yán)重溶血。葛根素廣泛應(yīng)用于缺血性心腦血管病、糖尿病的治療[4]，目前主要以注射劑的形式使用。由于葛根素的短消除半衰期和口服生物利用度差，經(jīng)常需要頻繁注射，隨著臨床的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)該藥有溶血、過敏和肝、腎損害等嚴(yán)重不良反應(yīng)，其中最嚴(yán)重的不良反應(yīng)報告以急性血管內(nèi)溶血為主。雖然近年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)聚乙二醇二氧化硅納米顆粒作為一種緩釋給藥系統(tǒng)，可延長葛根素半衰期和提高藥物生物利用度，改善血液相容性低溶血，減少由葛根素引起的溶血不良作用，但距離實際臨床應(yīng)用尚有一段距離。由于目前學(xué)界內(nèi)還沒有常規(guī)針對葛根素血藥濃度的檢測方法，因此，對葛根素注射液在臨床上的安全應(yīng)用濃度目前還沒有共識。G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞穩(wěn)定性不如正常細(xì)胞，前文提及臨床上我們觀察到2例G6PD缺乏者在使用含葛根素的方劑治療2型糖尿病時出現(xiàn)了嚴(yán)重的血管內(nèi)溶血[6,7]，由此引發(fā)我們探討葛根素注射液對G6PD缺乏者紅細(xì)胞溶血的影響。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞對遞增濃度的葛根素注射液抵抗力要低于正常紅細(xì)胞，且溶血度更高。葛根素注射液除了葛根素之外，主要輔料為丙二醇，根據(jù)既往文獻(xiàn)顯示，丙二醇的溶血危險來自高滲引發(fā)的紅細(xì)胞骨架破壞，而5%～10%的丙二醇溶液并不能引發(fā)細(xì)胞溶血，一般臨床使用的葛根素注射液，其輔料丙二醇的濃度遠(yuǎn)達(dá)不到高滲溶血的程度，因此我們認(rèn)為葛根素注射液對紅細(xì)胞的溶血作用還是主要由葛根素引發(fā)。G6PD缺乏患者紅細(xì)胞膜蛋白本身的穩(wěn)定程度由于GSH含量下降而遠(yuǎn)低于正常紅細(xì)胞，同時研究[8]顯示葛根素對正常紅細(xì)胞的溶血作用主要是一種非氧化性紅細(xì)胞毒性反應(yīng)，通過消耗細(xì)胞質(zhì)ATP直接或間接誘導(dǎo)血液毒性，引起溶血發(fā)生前紅細(xì)胞膜蛋白的降解;而G6PD缺乏的紅細(xì)胞由于膜蛋白的不穩(wěn)定性，相對正常紅細(xì)胞來說，對葛根素的耐受程度更低，因此高濃度的葛根素引起G6PD患者急性溶血的風(fēng)險會相對更高，提示臨床對G6PD缺乏的患者使用葛根素注射液時要更為謹(jǐn)慎。

G6PD的缺乏無法提供大當(dāng)量的還原力NADPH，且無法快速轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)，影響紅細(xì)胞對氧化性物質(zhì)的抵抗能力，而且G6PD缺乏可導(dǎo)致血液中GSH含量下降。GSH作為多種抗氧化酶的還原當(dāng)量的提供者，其濃度下降會影響紅細(xì)胞對外源氧化性物質(zhì)刺激的反應(yīng)。因此氧化刺激是導(dǎo)致G6PD缺乏者溶血的重要原因。葛根素屬于黃酮類化合物，具有的多酚結(jié)構(gòu)提供的活潑質(zhì)子與自由基結(jié)合成較穩(wěn)定的產(chǎn)物，因而有較強(qiáng)的抗氧化作用。本實驗我們用H2O2溶液模擬氧化損傷因素誘發(fā)G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞溶血時，發(fā)現(xiàn)低濃度葛根素注射液的加入有助于提高紅細(xì)胞對氧化損傷的抵抗作用，使紅細(xì)胞溶血程度降低，結(jié)果與既往文獻(xiàn)[9,10]符合。朱慶磊等[9]使用豚鼠紅細(xì)胞研究葛根素的抗氧化性損傷作用時發(fā)現(xiàn)，在0.48～1.60 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，葛根素對H2O2誘發(fā)的紅細(xì)胞溶血有抑制作用，且具濃度依賴性。本研究結(jié)果顯示，在0.6～0.9 mg/mL濃度范圍內(nèi)，葛根素對H2O2誘發(fā)的溶血并無顯著影響，在1.05～1.50 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞的溶血率反而與葛根素注射液濃度正相關(guān)，因此認(rèn)為,低濃度葛根素注射液能提高G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞對H2O2的耐受能力，但葛根素注射液濃度1.05～1.50 mg/mL時，G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞溶血加重,可能由于G6PD缺乏癥患者的紅細(xì)胞對葛根素的耐受力弱于正常的紅細(xì)胞，因此在相近的濃度范圍內(nèi)，葛根素已經(jīng)促使患者的紅細(xì)胞發(fā)生溶血。

綜上所述，與健康體檢者的紅細(xì)胞相比，1.75～3.35 mg/mL的葛根素注射液增加G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞溶血率，即G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞對1.75～3.35 mg/mL的葛根素注射液的耐受力減低。H2O2濃度為9.9～13.5 mg/mL時，隨著H2O2濃度遞增，1.15 mg/mL葛根素可使G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞溶血率降低。低濃度(0.60～0.90 mg/mL)葛根素注射液能提高G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞對8.1 mg/mL H2O2的耐受能力，但葛根素注射液濃度為1.05～1.50 mg/mL時，G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞對8.1 mg/mL H2O2的耐受能力降低。低濃度的葛根素注射液雖然能提高G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞的抗氧化作用，但由于G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞膜蛋白的不穩(wěn)定因素，因此其安全用藥濃度要遠(yuǎn)低于正常人，臨床針對G6PD缺乏癥患者使用葛根素注射液時要尤為注意預(yù)防急性溶血的發(fā)生。