李乾鵬，冉學紅，朱旭，劉洋，盛志新，劉麗萍

(濰坊市人民醫(yī)院，山東濰坊261000)

急性髓系白血病(AML)是一組高度異質(zhì)性、源于白血病干細胞的惡性克隆性疾病群[1]。隨診療技術(shù)的提高，AML患者預后得到很大改善，但因AML易復發(fā)和耐藥，導致現(xiàn)階段治療失敗率較高[2]。對AML復發(fā)耐藥機制深入研究，有助于探索更有效的診療手段。果蠅zeste基因增強子同源物2(EZH2)[3,4]具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，在多種惡性實體腫瘤(如卵巢癌、胃癌等)中高表達，且與預后不良相關(guān)[4～6]。新近報道顯示，血液系統(tǒng)惡性腫瘤中EZH2呈高表達，并且EZH2高表達多發(fā)生在高危患者[3]，提示EZH2參與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。張力蛋白同源的10號染色體缺失的磷酸酶基因(PTEN)是一種具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因，位于10號染色體上[7]。PTEN可使PIP3去磷酸化，調(diào)節(jié)細胞的增殖與存活[8]。PTEN在腫瘤組織中低表達，是某些腫瘤(如膀胱癌、胃癌等)診斷及預后的重要參考指標。研究表明，PTEN表達或活性水平微量降低可導致腫瘤易感性增強[8]。另有報道顯示，PTEN表達缺失可促進白血病干細胞產(chǎn)生[8,9]。由此可見，PTEN在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。為探討EZH2、PTEN在AML發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究采用實時熒光定量PCR法檢測AML患者骨髓單個核細胞中的EZH2、PTEN mRNA表達，并分析EZH2 mRNA與PTEN mRNA表達的相關(guān)性，為AML的診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 骨髓單個核細胞來源 選取濰坊市人民醫(yī)院血液科2014年3月～2015年3月收治的AML患者60例納入AML組，其中男29例、女31例，年齡16～82(47.24±7.91)歲。AML診斷標準參照《血液診斷及療效標準第3版》。另選擇因貧血、不明原因出血等行骨髓穿刺檢查者20例為正常對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。采集兩組研究對象的骨髓液5 mL，無菌條件下EDTA抗凝處理，加入紅細胞裂解液，室溫靜置10 min，1 300 r/min離心10 min，PBS洗滌2次，獲得骨髓單個核細胞。

1.2 骨髓單個核細胞中EZH2、PTEN mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。用TRIzol提取骨髓單個核細胞總RNA，檢測總RNA純度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR反應。PCR反應體系參照Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒配置。反應條件為94 ℃反應5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共計40個循環(huán)終止反應；在PCR循環(huán)第二步60 ℃時收集熒光信號，設空白對照。內(nèi)參β-actin上游引物序列為5′-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3′，下游引物序列為5′-ATGCTATCACCTCCCCTGTG-3′；人EZH2基因上游引物序列為5′-GACCCTGACCTCTGTCTTACTT-3′，下游引物序列為5′-GATGGTGCCAGGCAATAGATG-3′。人PTEN上游引物序列為5′-CTATTCCCAGTCAGAGGCGCTAT-3′，下游引物序列為5′-TGAACTTGTCTATCCCGTCGTGT-3′。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 AML組及正常對照組骨髓單個核細胞中EZH2、PTEN mRNA表達比較 AML組及正常對照組骨髓單個核細胞中EZH2 mRNA相對表達量分別為284.8±15.9、100.0±7.2，AML組及正常對照組骨髓單個核細胞中PTEN mRNA相對表達量分別為30.8±3.6、103.0±7.5。AML組骨髓單個核細胞中EZH2 mRNA相對表達量高于正常對照組，PTEN mRNA相對表達量低于正常對照組(P均<0.01)。

2.2 AML患者骨髓單個核細胞中EZH2 mRNA、PTEN mRNA表達的相關(guān)性 AML患者骨髓單個核細胞中EZH2 mRNA與PTEN mRNA相對表達量呈負相關(guān)(r=-0.694，P<0.05)。

3 討論

AML是嚴重威脅人類健康的造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病[1,10]。AML的發(fā)病率逐年增加，且5年生存率小于50%[2,10]。化療作為AML的主要治療手段，已取得較大進展，但由于耐藥現(xiàn)象的存在，多數(shù)患者仍出現(xiàn)難治、復發(fā)，最終導致治療失敗[11]。表觀遺傳學變異在白血病的復發(fā)耐藥中具有重要作用。白血病細胞耐藥的主要機制包括DNA損傷修復異常、細胞周期紊亂、細胞凋亡逃逸、藥物代謝干擾、藥物靶點變異、藥物轉(zhuǎn)運障礙等。

EZH2基因位于染色體7q35，是PcG復合物的核心組成部分[12]。EZH2可三甲基化組蛋白H3的27位賴氨酸，發(fā)揮基因沉默的生物學效應；亦可通過甲基化依賴的泛素化機制降解RORα，沉默相關(guān)基因[3]。另外，EZH2也有基因活化的作用，如通過與β-catenin、ERα相互作用，導致ERα/β-catenin/Wnt通路活化，通過與RelA/RelB相互作用激活NF-κB[13,14]。EZH2在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲、耐藥中發(fā)揮重要作用，主要機制包括miRNA沉默、腫瘤免疫逃逸、非經(jīng)典轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等[15]。在血液系統(tǒng)中，EZH2對維持造血干細胞的自我更新、分化有重要意義[13]。EZH2在AML、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤等惡性血液系統(tǒng)疾病中異常表達，且高表達EHZ2的患者預后差、易復發(fā)[16]。在血液系統(tǒng)疾病中，EZH2表現(xiàn)出雙重作用，如在彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤中，EZH2存在功能獲得性突變；而在骨髓增生異常綜合征、骨髓增生異常綜合征/骨髓增殖性腫瘤、骨髓纖維化中，EZH2表現(xiàn)出功能缺失性突變[3]。

PTEN有9個外顯子和8個內(nèi)含子，其編碼的蛋白在胞質(zhì)中表現(xiàn)出雙重特異性磷酸酶活性，即蛋白酪氨酸磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸酶活性[8]。在分子遺傳學水平，PTEN通過調(diào)控重要的信號通路與細胞代謝過程影響細胞基因的穩(wěn)定性。在細胞水平，PTEN在干細胞的自我更新、細胞周期等方面具有重要作用[17]。在前列腺組織中，PTEN表達缺失導致腫瘤細胞增殖和腫瘤發(fā)生；在胚胎神經(jīng)干細胞，PTEN表達缺失可促進干細胞的自我更新及加速細胞周期從G0期向G1期進展[8]。在血液系統(tǒng)，PTEN缺失可導致正常造血干細胞過度增殖并演變?yōu)榘籽「杉毎鸞17,18]。白血病干細胞中PTEN表達缺失導致干細胞基因不穩(wěn)定，如β-catenin激活、Myc基因過表達等癌基因表達異常，上述癌基因異常表達又進一步促進白血病干細胞增殖，以此形成惡性反饋[8]。除此之外，PTEN缺失還可激活JAK2/STAT3通路及促進腫瘤微環(huán)境中免疫抑制因子的釋放，導致腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸[8]。因此，PTEN是一種重要的抑癌基因，其正常表達能夠抑制細胞過度增殖、促進細胞生理性凋亡、減少DNA損傷并抑制腫瘤細胞的代謝[8]。“胞核池”中PTEN表達水平對于維持細胞基因穩(wěn)定性至關(guān)重要；PTEN表達缺失會導致細胞基因的完整性受損[8,19]，出現(xiàn)原癌基因(如Myc)過表達及抑癌基因(如p53)低表達或缺失，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展與復發(fā)耐藥。

本研究結(jié)果顯示，AML組骨髓單個核細胞中EZH2 mRNA相對表達量高于正常對照組，PTEN mRNA相對表達量低于正常對照組；AML患者骨髓單個核細胞中EZH2 mRNA與PTEN mRNA表達呈負相關(guān)。這提示EZH2和PTEN與AML的發(fā)病有關(guān)，且二者之間可能存在一定的相互作用。我們推測，PTEN表達缺失可能是腫瘤發(fā)生的誘發(fā)因子。低水平的PTEN導致細胞中重要的癌基因EZH2穩(wěn)定性減低，導致EZH2過度表達，進而參與AML的發(fā)病。我們先前研究發(fā)現(xiàn)促癌因子EVI1 mRNA在AML患者中高表達，PTEN mRNA在AML患者中低表達，二者亦呈負相關(guān)[20]，推測在AML中PTEN缺失導致癌基因EZH2與EVI1突變，二者過度表達，最終誘發(fā)AML的發(fā)生發(fā)展。在此過程中是否有其他基因參與仍需要進一步驗證。關(guān)于PTEN與EZH2、EVI1之間的相互作用及其機制也有待研究證實。