杜秋蓉，杜 笠，胡瓊英，劉祥琴

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610075；2.成都天府新區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610213；3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610072)

結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核的病原菌。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2017年有130萬人死于結(jié)核病[1]，且每年多達(dá)1000萬人繼續(xù)患結(jié)核病，仍然是全球主要的健康威脅[2]。結(jié)核分枝桿菌主要檢測的途徑有抗酸染色涂片法，細(xì)菌快速培養(yǎng)法以及利用熒光PCR法。根據(jù)大量文獻(xiàn)的研究結(jié)果顯示，熒光PCR的檢測方法對結(jié)核分枝桿菌的檢出率較高，也是快速、特異、準(zhǔn)確且經(jīng)濟的方法，優(yōu)于抗酸染色涂片法和細(xì)菌快速培養(yǎng)法等各類方法[3～5]。本文收集了四川省人民醫(yī)院及成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院2017年1月至2018年7月確診為肺結(jié)核的132例患者的標(biāo)本，進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌核酸檢測，分析檢測結(jié)果，從而探索標(biāo)本類型(支氣管灌洗液、痰液、血液)對肺結(jié)核檢出情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料2017年1月至2018年7月四川省人民醫(yī)院及成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診就診的132例肺結(jié)核患者，均根據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2017》[6]確診，同時采集痰液、支氣管灌洗液及血標(biāo)本送檢，進(jìn)行熒光PCR技術(shù)，分析檢測結(jié)果。

1.2 儀器與試劑儀器：美國ABI 7500實時熒光PCR儀。試劑：達(dá)安基因股份有限公司結(jié)核桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光法)。

1.3 方法

1.3.1標(biāo)本的采集 ①痰液的采集及處理：用無菌杯取受檢者肺深部咳出痰液1～3 ml密閉送檢。痰液中加入1倍體積的4%NaOH，37 ℃放置30分鐘左右液化(每間隔10分鐘搖勻一次)，取1.0 ml到1.5 ml離心管中，振蕩搖勻，離心12000 rpm 5分鐘。去上清，沉淀加無菌生理鹽水1 ml混勻，再次12000rpm離心5分鐘，重復(fù)洗滌兩次，移去上清，沉淀備用。②支氣管灌洗液的采集及處理：用無菌杯收集支氣管灌洗液5～10 ml密閉送檢，所取標(biāo)本有黏液時同痰標(biāo)本的處理；無黏液時，混勻后取1 ml離心12000 rpm 5分鐘，移去上清，沉淀加無菌生理鹽水1 ml混勻，再次12000rpm離心5分鐘，洗滌一次，移去上清，沉淀備用。③血液的采集及處理：抽取靜脈血1 ml(抗凝)，用生理鹽水稀釋1 ml，慢慢轉(zhuǎn)移至含淋巴細(xì)胞分離液1 ml的無菌管中(切勿混勻)，離心2000 rpm 10分鐘，吸取白細(xì)胞層于1.5 ml離心管，離心12000 rpm 5分鐘，棄上清，沉淀加無菌生理鹽水1 ml混勻，離心12000 rpm 5分鐘，洗滌一次，移去上清，沉淀備用。

1.3.2核酸的制備 將上述備用的沉淀標(biāo)本中分別加入50 μl TB-DNA提取液充分混勻，6000 rpm離心60秒，置于100 ℃金屬浴10分鐘裂解，待冷卻后取出，12000rpm離心5分鐘，上清液備用。

1.3.3質(zhì)量控制 試劑盒的陰性對照及質(zhì)控物與檢測標(biāo)本同樣處理，提取核酸。

1.3.4PCR擴增 取單管單人份的TB-DNA的PCR反應(yīng)管若干(N+2個，N代表樣本數(shù)，2分別代表一個陽性質(zhì)控，一個陰性質(zhì)控)，分別加入處理后樣品或者陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品5 μl，并6000rpm離心60秒。將上述各反應(yīng)管放入ABI 7500型實時熒光PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴增，反應(yīng)條件：93 ℃→2分鐘預(yù)變性，之后93 ℃ 45秒→55 ℃60秒，反應(yīng)10個循環(huán)，93 ℃ 30秒→55 ℃45秒30個循環(huán)。

1.3.5結(jié)果分析 反應(yīng)結(jié)束后，將檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)保存至電腦，然后對圖像結(jié)果進(jìn)行分析并調(diào)節(jié)baseline的start值(2～4)，stop值(7～9)及Threshold值，再到Reporter窗口觀察并記錄儀器自動分析得出的Ct值。質(zhì)控：陰性質(zhì)控為陰性(Ct值>臨界陽性質(zhì)控，同時Ct值≥30)，擴增曲線無增長，則本次實驗有效；陽性質(zhì)控為陽性(Ct值<臨界陽性質(zhì)控Ct值)，有明顯擴增曲線，則本次實驗有效。標(biāo)本結(jié)果判斷，在陰、陽性質(zhì)控結(jié)果有效的情況下，陰性結(jié)果Ct值≥30，無擴增曲線，則結(jié)果判斷為陰性。如Ct值<28，有明顯擴增曲線，則結(jié)果判斷為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

132例患者三種不同標(biāo)本中，支氣管灌洗液檢出結(jié)核分枝桿菌123例，未檢出9例，陽性檢出率93.2%；痰液檢出結(jié)核分枝桿菌94例，未檢出38例，陽性檢出率71.2%；血液檢出結(jié)核分枝桿菌5例，未檢出127例，陽性檢出率3.8%。檢出率最高的標(biāo)本為支氣管灌洗液，其次為痰液，最低為血液標(biāo)本。見表1。

表1 三種標(biāo)本檢出TB-DNA的陽性結(jié)果比較

①與痰液比較，χ2=21.8，P< 0.05；②與血液比較，χ2=211.2，P< 0.05；③與血液比較，χ2=128.0，P< 0.05

3 討論

結(jié)核病的病原體是由分枝桿菌屬的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群感染所致，該復(fù)合菌群含有引起人和動物感染發(fā)病的若干亞群，這些亞群感染人體組織后其臨床表現(xiàn)類似，引起的組織學(xué)改變也相似，都能導(dǎo)致肉芽腫性炎變，伴或不伴干酪樣壞死[7]。由于該類細(xì)菌抗酸染色都呈陽性，因此單純依據(jù)抗酸染色結(jié)果和組織學(xué)改變來診斷結(jié)核病并不可靠。然而利用熒光PCR的方法進(jìn)行TB-DNA的PCR反應(yīng)，每復(fù)制1個特異核苷酸片段，就有1個探針被切斷，并釋放一個熒光信號。因為被釋放的熒光基團數(shù)目和PCR產(chǎn)物是一對一的關(guān)系，所以用熒光檢測技術(shù)檢測出的熒光信號有無或強弱，則代表擴增產(chǎn)物有無或多少。熒光PCR技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌的診斷具有快速、特異、敏感等特點，因此也成為結(jié)核病分子診斷的最有力的方法[8]。本文利用熒光PCR技術(shù)對臨床常用三種標(biāo)本(痰液、支氣管灌洗液、血液)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行了分析，其目的就是為臨床提供科學(xué)的、合理的采集標(biāo)本。

對于血液標(biāo)本來說，由于結(jié)核分枝桿菌的生長特點，一般不會是在血液中繁殖，只是通過血液等傳播到相應(yīng)的組織、器官等形成病灶，血液具有流動性，在血液中采集結(jié)核分枝桿菌具隨機性，故而血液中的結(jié)核分枝桿菌不易采集到且其存在的量也很少。再次，只有在結(jié)核分枝桿菌感染早期或者通過血液再次繼發(fā)感染其他組織或者器官時，血液標(biāo)本才可能檢測到結(jié)核分枝桿菌(臨床認(rèn)知不足，認(rèn)為采血方便)，所以血液標(biāo)本對結(jié)核分枝桿菌檢出率很低。本研究結(jié)果也證實了這一點。在確診肺結(jié)核患者的132例血液標(biāo)本，檢出陽性的只有5例，未檢出的則占大部分。

對于痰液標(biāo)本，現(xiàn)在的患者并不都能完全的深咳出合格痰液，且肺結(jié)核患者多為少痰或無痰，再次，臨床結(jié)核的排菌特點——間歇排菌，導(dǎo)致臨床上痰找抗酸桿菌陽性率低，易漏診誤診[9]。所以從本試驗確診肺結(jié)核的痰液標(biāo)本共132例，檢出的有94例，檢出率僅有71.2%，未檢出的有38例。而支氣管灌洗液檢出率達(dá)93.2%，這與痰液標(biāo)本檢出率71.2%相比較，就可說明這132例患者痰液中未檢測出陽性結(jié)果的不是患者本身沒有結(jié)核分枝桿菌，而是采集到的標(biāo)本可能沒有結(jié)核分枝桿菌存在，檢出率自然降低。故臨床醫(yī)生選擇痰液標(biāo)本，為避免漏檢，應(yīng)多次采樣檢測。

肺泡灌洗液是利用支氣管鏡向支氣管及肺泡內(nèi)注入生理鹽水并吸出。收集肺泡表面的有效液體進(jìn)行可溶物或者細(xì)胞的檢查。對于支氣管灌洗液，采集此類標(biāo)本時，肺泡灌洗液進(jìn)入遠(yuǎn)端氣道和肺泡腔中，接觸病灶范圍較廣，標(biāo)本量較大，含菌量較多且借助外力采取，因此主觀影響因素較少，最后標(biāo)本充分離心沉淀，檢出率可大大提高。同時，灌洗刺激患者咳嗽，更有利于局部支氣管分泌物的引流，還可避免口咽部細(xì)菌對樣本的污染[10]。并且，支氣管肺泡灌洗術(shù)是一種安全的檢測方法，即使對兒童，其安全性也能得到保證[11]。以上充分證實了，支氣管灌洗液此類標(biāo)本是檢測肺結(jié)核中結(jié)核分枝桿菌的最佳標(biāo)本類型。然而，在此次的調(diào)查結(jié)果中利用支氣管灌洗液這類標(biāo)本檢測結(jié)核分枝桿菌，有9例患者未測得陽性結(jié)果，其原因有可能是標(biāo)本采集不當(dāng)，或未采集到結(jié)核分枝桿菌，也有可能是采集到的細(xì)菌數(shù)量較少，在利用熒光PCR法提取標(biāo)本時，未提取到達(dá)檢測范圍的量，未能檢測出。所以，針對結(jié)核分枝桿菌的檢測都應(yīng)多次采樣檢測，以防漏檢。

總之，利用熒光PCR測定肺結(jié)核中的TB-DNA，檢出率最高的標(biāo)本類型是支氣管灌洗液，支氣管灌洗液的檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于痰液和血液的檢出率。這與多年利用熒光PCR法測定結(jié)核分枝桿菌的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)相吻合，證實了血液對于結(jié)核分枝桿菌的檢測確實檢出率太低，檢測價值不大這一結(jié)論。提示臨床醫(yī)生在選擇利用PCR技術(shù)檢查肺部及肺周結(jié)核分枝桿菌時可首選支氣管灌洗液這類標(biāo)本，并且不同時段多次采樣，減少漏檢率。因此，利用熒光PCR技術(shù)檢測支氣管灌洗液中的TB-DNA，這一方法和實驗標(biāo)本可以準(zhǔn)確，簡便，快速測定出結(jié)核分枝桿菌，其值得推廣應(yīng)用。