閔文蛟，黃雨蘭，汪瑾宇，鄒志禮，楊程惠，周 波

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院心身醫(yī)學(xué)中心，四川 成都 610072)

驚恐障礙以反復(fù)心悸、氣緊等發(fā)作，伴強(qiáng)烈瀕死感或失控感為特征；患者常反復(fù)就醫(yī)，社會(huì)功能受到嚴(yán)重影響。目前認(rèn)為遺傳因素對PD發(fā)病具有重要作用[1]。miRNA可參與調(diào)節(jié)大約30%的人類蛋白質(zhì)翻譯，成為腦發(fā)育異常、神經(jīng)遞質(zhì)改變和不同治療反應(yīng)的統(tǒng)一鏈接[2]。miRNA-1廣泛存在于甲狀腺、心臟等器官中，與代謝性疾病、精神疾病等密切相關(guān)[3]。本研究探討miR-1與驚恐障礙發(fā)病及藥物療效的關(guān)聯(lián)性，為疾病預(yù)測及治療轉(zhuǎn)歸提供可能的血清標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料2014年7月至2015年8月我院收治的67例驚恐障礙住院患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①中國漢族驚恐障礙患者，年齡18～55歲，性別不限；②符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊》第四版(DSM-IV) 驚恐障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)，由統(tǒng)一培訓(xùn)的富有經(jīng)驗(yàn)的精神科醫(yī)師通過系統(tǒng)精神檢查確診(其一致性檢驗(yàn)的Kappa值大于0.8)；③14項(xiàng)基線漢密爾頓焦慮量表(HAMA)量表評分>14分[1]；④入組前2周內(nèi)未接受任何抗焦慮藥物治療(其中4周內(nèi)未接受氟西汀治療)；⑤未接受任何激素治療；⑥女性患者未使用任何口服避孕藥物；⑦簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往患有或合并其它精神疾病，包括精神分裂癥、雙相情感障礙、抑郁癥、精神活性物質(zhì)濫用或依賴、強(qiáng)迫癥、精神發(fā)育遲滯以及藥物所致精神障礙等，以及存在軸Ⅱ類疾病，包括人格障礙等；②患有嚴(yán)重軀體疾病，包括內(nèi)分泌、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，嚴(yán)重腦外傷史，體格檢查或?qū)嶒?yàn)室檢查發(fā)現(xiàn)明確異常者；③懷孕或哺乳期婦女。同期63例西南地區(qū)漢族健康人群(對照組)，年齡18～55歲，性別與病例組匹配，且具有相似的人文地理背景。并由統(tǒng)一培訓(xùn)的評估人員使用DSM-IV軸I定式臨床精神檢查(SCID-NP)，排除目前或既往患有精神疾病或嚴(yán)重軀體疾病者。

1.2 方法

1.2.1評估與治療 收集所有研究對象的年齡、性別、文化程度、婚姻等基本人口學(xué)資料。病例組患者在入組時(shí)進(jìn)行基線HAMA-14及驚恐障礙嚴(yán)重程度量表(PDSS)評估；入組后接受為期6周的舍曲林治療(50～200 mg/d，根據(jù)病情調(diào)整劑量)，期間除失眠及發(fā)作時(shí)使用阿普唑侖或吸氧治療外，不能使用其它藥物及非藥物治療方案。治療結(jié)束后，所有患者再次接受HAMA-14及PDSS量表評估。HAMA-14包含2個(gè)因子：軀體性焦慮(7～13條目)、精神性焦慮(1～6和14條目)。PDSS減分率超過40%被定為臨床有效；HAMA-14得分小于7分且無驚恐發(fā)作及社會(huì)功能損害被定為臨床治愈[1]。

1.2.2血樣采集及遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn) 所有研究對象在入組時(shí)均采集5 ml外周靜脈血，病例組在6周治療完成后再次采集5 ml外周靜脈血。所有采集的血樣標(biāo)本使用EDTA抗凝，4°C離心分層，保留上層清液(血漿)，并留取1 ml進(jìn)行RNA提取。根據(jù)說明使用TRIZOL-LS試劑提取血漿RNA，并使用NanoDrop ND-1000進(jìn)行RNA濃度和純度檢測。使用ViiA7 RT-PCR系統(tǒng)檢測樣本中miR-1表達(dá)水平，引物：F：5’ GGGGTGGAATGTAAAGAAGT3’，R：5’CAGTGCGTGTCGTGGAGT3’。8 μl反應(yīng)液體系如下：1 μl cDNA、5 μl 2倍Master混合液、10 μM的正反引物各0.5 μl、1 μl純凈水。PCR反應(yīng)條件如下：95°C預(yù)變性10分鐘，之后95°C變性10秒、60°C退火60秒、95°C延伸15秒，此三步重復(fù)40個(gè)循環(huán)。使用hsa-miR-423-5p作為內(nèi)參[4]，并使用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對表達(dá)水平計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

納入的研究對象中，7例患者及3例健康對照者血樣標(biāo)本不合格(血樣標(biāo)本量過少或溶血)而剔除。最終60例患者及60例對照者納入統(tǒng)計(jì)分析。

2.1 兩組基本人口學(xué)資料及miR-1表達(dá)水平比較

病例組男∶女=2∶3，年齡(35.13±10.09)歲，對照組男∶女=4∶11，年齡(32.13±7.62)歲，兩組基本人口學(xué)資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。病例組miR-1表達(dá)水平低于對照組(1.098±0.388vs4.117±2.643，t=-4.375，P<0.001)。

2.2 治療前miR-1表達(dá)水平與臨床特征及量表評分的相關(guān)性分析miR-1表達(dá)水平與發(fā)病年齡及病程均無相關(guān)(P> 0.05)。miR-1表達(dá)水平與HAMA13條目(自主神經(jīng)癥狀)和PDSS3條目(預(yù)期性焦慮的嚴(yán)重程度)得分呈負(fù)相關(guān)(P<0.001)，見表1。

表1 治療前miR-1表達(dá)水平與HAMA-14、PDSS量表評分的相關(guān)性

2.3 治療前后miR-1表達(dá)水平比較治療后miR-1表達(dá)水平較治療前下降(1.098±0.388vs0.377±0.369，t=5.14，P< 0.001)。miR-1表達(dá)水平的變化與HAMA-14、PDSS量表各項(xiàng)評分變化之間不存在關(guān)聯(lián)性(P> 0.05)，見表2。

3 討論

雖然遺傳因素被認(rèn)為在驚恐障礙的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，連鎖關(guān)聯(lián)性分析亦發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)致病相關(guān)基因多態(tài)性，如COMT的val158 met、TPH的rs4570625、5-HTTLPR等[5]。但其研究結(jié)果目前尚不一致，陽性重復(fù)率較低[6]。而miRNA被認(rèn)為可能代表了一種新層次上的基因表達(dá)調(diào)控方式，其表達(dá)量的改變會(huì)影響腦內(nèi)許多相關(guān)基因的表達(dá)，在精神障礙的基因組復(fù)合結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)中起到重要調(diào)控作用[7]。同時(shí)，既往研究發(fā)現(xiàn)，抗精神病藥物亦可改變體內(nèi)特定miRNA的表達(dá)，并隨病情改善而變化[8]。Kim等在韓國人群中發(fā)現(xiàn)miR-22、miR-491多態(tài)性變異與驚恐障礙遺傳易感性相關(guān)[9]。但迄今為止，關(guān)于驚恐障礙的miRNA相關(guān)研究較少，結(jié)果可重復(fù)性不高，尚處于起步階段。

表2 治療前后miR-1表達(dá)水平變化與HAMA-14、PDSS量表評分變化的相關(guān)性

△治療前后量表評分變化值；#治療前后miR-1表達(dá)水平變化

miRNA-1是一種研究較為廣泛的miRNA分子，在多種疾病發(fā)生及治療中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-1在肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種腫瘤疾病中表達(dá)下調(diào)[10]，其上游啟動(dòng)子C/EBPα(含亮氨酸鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族成員) 常在上述疾病中失活。miR-1能調(diào)節(jié)多種致癌基因的表達(dá)，并在下游經(jīng)典致癌基因信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]；它可以調(diào)節(jié)甲基化相關(guān)酶而改變腫瘤細(xì)胞DNA的甲基化狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。此外，miR-1通過抑制Hand2的蛋白表達(dá)，在心肌發(fā)育和抑制心肌肥厚過程中發(fā)揮重要功能，伴或不伴糖尿病的心肌肥大患者中miR-1表達(dá)均出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為明顯下調(diào)[12]。本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-1在驚恐障礙患者血漿中表達(dá)明顯下調(diào)；同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)miR-1表達(dá)水平與驚恐障礙患者自主神經(jīng)癥狀和預(yù)期性焦慮密切相關(guān)，其表達(dá)水平越低，患者的焦慮水平及四肢發(fā)麻、心慌、胸悶等軀體癥狀越明顯，能在一定程度上成為疾病發(fā)生及臨床癥狀嚴(yán)重程度水平的預(yù)測分子。而miR-1在心肌、骨骼肌組織中特異性表達(dá)，與心肌疾病、腫瘤發(fā)生的密切相關(guān)；研究發(fā)現(xiàn)，miR-1表達(dá)下調(diào)可能誘發(fā)心律失常，這與miR-1參與調(diào)節(jié)內(nèi)源性鈣離子交換通路基因Stx6有關(guān)[13]；因此不排除驚恐障礙可能存在與心律失常、腫瘤等疾病相關(guān)或相似的靶基因調(diào)控通路，這為驚恐障礙的進(jìn)一步病理生理機(jī)制研究提示了一定線索。

目前認(rèn)為miR-1能夠引發(fā)細(xì)胞凋亡，并由此成為化療的潛在靶點(diǎn)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-1與驚恐障礙藥物治療效果相關(guān)聯(lián)，經(jīng)過6周舍曲林治療后患者血漿表達(dá)水平明顯降低，這雖然與前述的miR-1在病例組表達(dá)水平下調(diào)相矛盾，但仍然提示miR-1可能在抗焦慮藥物作用機(jī)制中發(fā)揮重要作用，也為今后疾病治療藥物的研發(fā)提供了一定方向。但由于miR-1的表達(dá)亦受到表觀遺傳的修飾作用，例如肺癌細(xì)胞中核小體組蛋白超乙?；梢种破浔磉_(dá)[15]，肝癌細(xì)胞中，miR-1-1的CGI甲基化亦會(huì)引起miR-1表達(dá)受抑制，而miR-1的缺失可引起肝癌相關(guān)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9 a的上調(diào)[16]。因此，我們設(shè)想本研究發(fā)現(xiàn)在治療后miR-1水平反而下降的結(jié)果不排除可能在藥物作用過程中可能同時(shí)激活了對miR-1產(chǎn)生抑制的表觀遺傳修飾，這亦需要今后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本以及進(jìn)行靶基因?qū)用娴奶接懸悦鞔_。

本研究存在的局限：由于條件有限，研究樣本量相對偏少，可能對結(jié)果的統(tǒng)計(jì)效能產(chǎn)生一定影響，但本研究仍揭示了miR-1與驚恐障礙發(fā)病及轉(zhuǎn)歸存在關(guān)聯(lián)性趨勢，有助于今后大樣本進(jìn)一步探討。本研究入組患者僅使用舍曲林治療，未能評估其它抗焦慮藥物療效與miR-1表達(dá)水平變化之間的關(guān)聯(lián)性，但單一藥物治療有助于避免不同藥物效應(yīng)的混雜因素，使得結(jié)果更為可靠。今后可進(jìn)行不同藥物治療分組，探討miRNA表達(dá)水平與不同藥物療效之間的相關(guān)性。

總之，本研究首次在中國漢族人群中揭示了miR-1與驚恐障礙發(fā)病以及療效的關(guān)聯(lián)性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該miRNA表達(dá)與患者的焦慮水平及自主神經(jīng)癥狀密切相關(guān)，為進(jìn)一步在分子遺傳學(xué)方面探討疾病發(fā)生及轉(zhuǎn)歸提供了一定線索，也有助于今后基于基因表達(dá)調(diào)控的個(gè)體化優(yōu)化治療方案的開展。