劉紅霞 施 真

濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室 煙臺(tái) 264003

肥胖是全球性健康問(wèn)題，嚴(yán)重威脅人類身體健康。眾多研究均已證實(shí)肥胖和高血壓密切相關(guān)[1]。肥胖中腹型肥胖與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系尤為顯著[2]，有研究表明內(nèi)臟脂肪與皮下脂肪比與原發(fā)性高血壓具有高相關(guān)性[3]。最新研究證實(shí)脂肪組織來(lái)源的microRNAs (miRNAs)是循環(huán)miRNAs的主要來(lái)源[4]，而Dicer是miRNAs形成的關(guān)鍵酶，在Dicer作用下前小RNA才能成為成熟miRNAs，因此Dicer表達(dá)量高低通過(guò)影響miRNAs可在多種疾病中發(fā)揮重要作用。但內(nèi)臟脂肪組織中Dicer表達(dá)量在肥胖高血壓患者是否異常尚無(wú)研究。本研究通過(guò)采集臨床腹部擇期手術(shù)患者內(nèi)臟脂肪，檢測(cè)其Dicer表達(dá)改變，分析其與肥胖高血壓發(fā)病之間的關(guān)系，為探明肥胖高血壓發(fā)病機(jī)制，尋找治療靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2014年12月至2018年8月某院收治的314例行擇期腹部手術(shù)患者為研究對(duì)象，本研究符合作者所在單位人體試驗(yàn)倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并取得病人的知情同意。年齡38～68周歲，男女不限；高血壓標(biāo)準(zhǔn)為收縮壓≥140 mmHg或舒張壓≥90 mmHg；根據(jù)體重指數(shù)(Body Mass Index, BMI)分為肥胖和正常體重患者，肥胖BMI≥25 kg/m2，正常體重BMI<25 kg/m2。314例納入研究患者中，>60歲者64例，31～40歲者81例，41～50歲者84例，51～60歲者85例。>60歲64例老年患者中，血壓正常者30例，高血壓患者34例。250例60歲以下患者中，正常體重正常血壓者83例，單純肥胖血壓正常者56例，單純高血壓正常體重者30例，肥胖高血壓患者81例。

1.2 主要儀器與試劑 Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；根據(jù)NCBI基因庫(kù)數(shù)據(jù)應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件primer 5.0設(shè)計(jì)Dicer和內(nèi)參GAPDH檢測(cè)引物，采用BLAST進(jìn)行比對(duì)，由Invitrogen公司合成。 Dicer正義鏈引物：5′-GTACGACTACCACAAGTACTTC-3′，反義鏈引物：5′-ATAGTACACCTGCCAGACTGT-3′；GAPDH正義鏈引物：5′-GGGAGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′，反義鏈引物：5′-CCATGCCAGTGAGCTTCCCGTTC-3′。熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TransGen Biotech公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Takara Bio公司。NanoDropND-1000分光光度計(jì)測(cè)定總RNA和cDNA含量和純度。qRT-PCR儀器為ThermoFisher公司QuantStudio 3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)臟脂肪組織采集 下腹腔內(nèi)臟周圍新鮮的脂肪組織200 mg，取樣時(shí)間控制在10 min以內(nèi)。剔除結(jié)締組織等非研究所需的組織。在RNase-free的0.9%生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。裝入凍存管，旋上蓋子，迅速投入液氮冷卻后將樣品轉(zhuǎn)移到-80℃保存。

1.3.2 脂肪組織總RNA的提取 每200 mg脂肪組織加1 mL trizol裂解，室溫靜置10 min，加入 0.2 mL氯仿，上下顛倒20 次，靜置 15 min，4℃ 12 000 rpm離心15 min，取上清400～500μL，加入 0.5 mL 異丙醇，上下顛倒20 次，室溫靜置10 min，4 ℃ 12 000 rpm離心10 min，棄上清，加入1 mL 75% 冰乙醇，輕輕彈開洗滌沉淀，4 ℃ 7 500 rpm離心5 min，棄上清晾干，加入15 μL Nase Free H2O溶解，Nanodrop測(cè)濃度和質(zhì)量，A280/A260≥1.8者可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 cDNA合成 根據(jù)試劑盒說(shuō)明首先去除基因組DNA反應(yīng)，10μL反應(yīng)體系中包含1μg總RNA，2.0 μL 5 × gDNA Eraser buffer，1.0 μL gDNA Eraser，42 ℃ 2 min 4 ℃離心，加入4.0μL RNase Free H2O，4.0μL 5 × PrimeScriptBuffer2，1.0 μL RT Primer Mix，1.0μL PrimeScript RTEnzyme Mix I配成20 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 sec，4 ℃離心。

1.3.4 熒光定量PCR 根據(jù)試劑盒說(shuō)明，20 μL反應(yīng)體系為正義鏈和反義鏈引物各0.4 μL(終濃度0.2 μM)，2×TransStar Tip Green qPCR SuperMix (+Dye I/+DyeII) 10 μL，cDNA模板2 μL，RNase Free H2O 7.2 μL，反應(yīng)步驟：94 ℃ 30 sec，94 ℃ 5 sec，50～60 ℃ 15 sec， 40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 sec后溶解曲線。采用2(-△△CT)相對(duì)定量法比較各組差異。

2 結(jié)果

2.1 年齡對(duì)內(nèi)臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達(dá)的影響 如圖1所示，與31～40歲患者(1.00±0.03)相比，41～50歲(1.46±0.34)，51～60歲患者(1.47±0.24)和60歲以上老年人(2.12±0.33)內(nèi)臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但41～50歲(1.46±0.34)及51～60歲患者(1.47±0.24)兩組患者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與41～50歲患者(1.46 ± 0.34)相比，60歲以上老年人(2.12 ± 0.33)內(nèi)臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與51～60歲患者(1.47±0.24)相比，60歲以上老年人(2.12±0.33)內(nèi)臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 單純肥胖對(duì)內(nèi)臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達(dá)的影響 如圖2所示，60歲以下患者中，與正常體重正常血壓者(1.00±0.21)相比，單純肥胖正常血壓患者(0.98±0.11)內(nèi)臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 不同年齡組內(nèi)臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達(dá)水平

圖2 非老年單純肥胖內(nèi)臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達(dá)水平

2.3 老年高血壓對(duì)內(nèi)臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達(dá)的影響 如圖3所示，60歲以上患者中，與正常血壓患者(1.00±0.10)相比，高血壓患者(0.79±0.12)內(nèi)臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 肥胖高血壓對(duì)內(nèi)臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達(dá)的影響 如圖4所示，60歲以下患者中，與正常體重正常血壓者(1.00±0.12)相比，單純高血壓患者(0.85±0.10)和肥胖高血壓患者(0.59±0.06)內(nèi)臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且與單純高血壓患者(0.85±0.10)相比，肥胖高血壓患者(0.59±0.06)內(nèi)臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 老年高血壓內(nèi)臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達(dá)水平

圖4 非老年高血壓內(nèi)臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達(dá)水平

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)隨年齡增長(zhǎng)，內(nèi)臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達(dá)顯著升高，而老年高血壓患者內(nèi)臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達(dá)顯著降低；去除年齡因素后，單純肥胖對(duì)內(nèi)臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達(dá)無(wú)顯著影響，而單純高血壓患者內(nèi)臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達(dá)顯著降低，肥胖高血壓患者內(nèi)臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達(dá)降低更顯著。這些結(jié)果表明內(nèi)臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達(dá)降低參與多種高血壓，如老年高血壓，尤其是肥胖高血壓的發(fā)生、發(fā)展。

高血壓是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病，發(fā)病率高，且治療效果不夠理想[5-6]，如何有效防治高血壓是醫(yī)學(xué)界急需攻克的重大醫(yī)學(xué)難題。肥胖是高血壓的重要易感因素。肥胖的關(guān)鍵組織——脂肪組織，一直被認(rèn)為只有能量?jī)?chǔ)存和平衡能量代謝的作用。近年來(lái)脂肪組織逐漸被認(rèn)為是內(nèi)分泌器官之一，其分泌的激素可調(diào)控其他組織器官功能，在包括高血壓在內(nèi)的代謝綜合征中發(fā)揮重要作用[7]。另外，眾多研究表明miRNAs在多種疾病[8]，包括心血管疾病發(fā)病中發(fā)揮重要作用[9]。最新研究結(jié)果[10]表明脂肪組織是循環(huán)血中microRNAs的主要來(lái)源，隨血液循環(huán)運(yùn)輸至其他組織，并調(diào)節(jié)其他組織基因表達(dá)和功能。而Dicer是miRNAs形成的關(guān)鍵酶，在Dicer作用下前小RNA才能成為成熟miRNAs，因此Dicer表達(dá)量高低通過(guò)影響miRNAs可在多種疾病中發(fā)揮重要作用。因此本研究選擇內(nèi)臟白色脂肪組織為研究對(duì)象，觀察其中Dicer表達(dá)量高低與高血壓的關(guān)系。

本研究收集2017年12月至2018年8月某院收治的28例行擇期腹部手術(shù)患者內(nèi)臟白色脂肪組織，并采集患者年齡、身高、體重、血壓指標(biāo)，經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)內(nèi)臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達(dá)量高低。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常血壓患者相比，高血壓患者內(nèi)臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達(dá)量并無(wú)顯著變化，這說(shuō)明可能存在其他因素與內(nèi)臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達(dá)增加相關(guān)，從而抵消了高血壓患者Dicer mRNA表達(dá)改變。因此本研究分別分析了年齡和肥胖與內(nèi)臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達(dá)的關(guān)系。首先將正常血壓患者按年齡分為31～40歲、41～50歲、51～60歲及60歲以上四組進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然51～60歲與41～50歲兩組無(wú)顯著差異，但均較31～40歲患者內(nèi)臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達(dá)顯著升高，且60歲以上患者升高更顯著，這些結(jié)果表明，隨年齡增長(zhǎng)內(nèi)臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達(dá)顯著增加。其次，將正常血壓患者按體重指數(shù)分為不肥胖和肥胖兩組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純肥胖因素并不影響內(nèi)臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達(dá)。

眾所周知，年齡也是高血壓的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。隨著年齡的增長(zhǎng)，高血壓發(fā)病率呈顯著增高趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)，與60歲以上正常血壓患者相比，60歲以上的高血壓患者內(nèi)臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達(dá)顯著下降。這說(shuō)明內(nèi)臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達(dá)下降與老年高血壓有密切關(guān)系。而去除年齡因素后，在60歲以下患者中，與正常體重、血壓患者相比，單純高血壓患者內(nèi)臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達(dá)量顯著下降。以上結(jié)果表明，高血壓患者無(wú)論年齡高低，內(nèi)臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達(dá)量均顯著下降。另外，去除年齡因素，即在60歲以下患者中，與正常體重、血壓者相比，肥胖高血壓患者內(nèi)臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達(dá)顯著降低，且較正常體重高血壓者降低更顯著，這些結(jié)果表明去除年齡因素后，內(nèi)臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達(dá)降低與肥胖高血壓患者更顯著相關(guān)。

綜上所述，內(nèi)臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達(dá)降低參與高血壓，尤其是肥胖高血壓的發(fā)生、發(fā)展，為以后更好的研究肥胖高血壓發(fā)病機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。