馬榮輝，董春嵐，韓有溪，曹國磊，羅琴

(新疆醫(yī)科大學第三附屬腫瘤醫(yī)院，烏魯木齊830000)

原發(fā)性肺癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均居全球惡性腫瘤首位，其中80%～85%的肺癌是非小細胞肺癌(NSCLC)。研究[1]顯示，超過半數(shù)的NSCLC患者初次診斷時即處于晚期。肺腺癌是最常見的NSCLC的組織學亞型，占50%以上[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體(EGFR)基因是NSCLC中發(fā)生發(fā)展過程中最重要的驅(qū)動基因之一。以吉非替尼為代表的EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)對EGFR基因突變型NSCLC療效顯著，已被作為此類患者的一線治療藥物[4]。雖然吉非替尼的臨床反應(yīng)良好，但許多患者在治療10～14個月時都會出現(xiàn)獲得性耐藥，最終導致治療失敗[5]。目前針對吉非替尼耐藥的NSCLC的新型靶向治療藥價格較貴，患者往往經(jīng)濟無法負擔或精神壓力較大而造成治療受阻，因此選用合適的輔助藥物提高吉非替尼對EGFR基因突變型NSCLC的敏感性、延緩耐藥、延長治療時間值得深入研究。華蟾素是我國自行研發(fā)的一種中藥抗腫瘤藥物，在腫瘤的協(xié)同放化療及靶向治療中被廣泛應(yīng)用[6]。研究[7～9]顯示，華蟾素對多種腫瘤細胞具有抑制作用，并且已經(jīng)引入到臨床治療中。本研究觀察了不同濃度華蟾素聯(lián)合吉非替尼對人非小細胞肺腺癌細胞株A549增殖、凋亡的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 華蟾素、細胞及試劑 華蟾素購自solarbio公司，人非小細胞肺腺癌細胞株A549由新疆醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院腫瘤研究所提供，吉非替尼購自國藥公司，MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司，流式細胞儀CytoFLEX購自BECKMAN公司，胎牛血清購自Invitrogen公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，DMEM購自GIBCO公司，兔多抗GAPDH(AB-P-R001)抗體購自杭州賢至生物有限公司，兔多抗met(156KD)抗體購自Bioworld公司，HRP標記羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 將A549細胞置于pH 7.2～7.4的含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的A549細胞，分為吉非替尼組、華蟾素組、聯(lián)合藥物組和對照組。吉非替尼組分別加入1、5、10、20、40 μmol/L的吉非替尼，記為A1、A2、A3、A4、A5組；華蟾素組分別加入0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg/mL的華蟾素，記為B1、B2、B3、B4、B5組；聯(lián)合藥物組分別加入1 μmol/L吉非替尼+0.005 mg/mL華蟾素、5 μmol/L吉非替尼+0.01 mg/mL華蟾素、10 μmol/L吉非替尼+0.05 mg/mL華蟾素、20 μmol/L吉非替尼+0.01 mg/mL華蟾素、40 μmol/L吉非替尼+0.5 mg/mL華蟾素，記為C1、C2、C3、C4、C5組；對照組加入等量DMSO。

1.3 各組細胞增殖能力觀察 取A549細胞，調(diào)整細胞密度至5×104/mL，接入96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，按照“1.2”方法進行分組處理，每組設(shè)3個復孔，37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)24、48、72 h時，加入10 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO震蕩10 min，以空白孔為空白組，酶標儀測定各孔在568 nm處的吸光度(OD)值，以O(shè)D值表示細胞增殖能力。實驗重復3次，取平均值。

1.4 A5、B5、C5和對照組細胞凋亡率測算 采用流式細胞術(shù)。取A549細胞，以2×105/孔接種于6孔板，按照“1.2”方法進行分組處理，選取A5、B5、C5和對照組細胞，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用不含EDTA的0.25%胰酶消化、收集細胞，PBS潤洗2次，加入500 μL Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL AnnexinV-FITC、5 μL PI混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 A5、B5、C5和對照組細胞c-met蛋白檢測 采用Western Blotting法。取A549細胞，加入3 mL 4 ℃預冷的PBS洗去培養(yǎng)液，加入400 μL含PMSF(100 mmol/L)的裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心5 min提取細胞總蛋白，BSA蛋白定量法測定蛋白濃度定量。取細胞總蛋白40 μg，加入緩沖液于沸水中煮沸10 min使蛋白變性，用微量加樣器將制備好的蛋白樣品和Maker加入上樣孔進行電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液浸泡，室溫搖床封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次，加入相應(yīng)的HRP標記二抗，37 ℃搖床孵育2 h，TBST洗滌PVDF膜5～6次，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光、顯影、定影，使用BandScan分析蛋白灰度值，計算目的蛋白的相對表達量。目的蛋白的相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖能力比較 ①A1、A2、A3、A4、A5組細胞培養(yǎng)24 h時的OD值分別為0.410±0.030、0.371±0.037、0.322±0.010、0.284±0.025、0.196±0.020，B1、B2、B3、B4、B5組分別為0.463±0.021、0.454±0.017、0.472±0.013、0.460±0.009、0.452±0.028,C1、C2、C3、C4、C5組分別為0.412±0.016、0.359±0.023、0.306±0.035、0.249±0.020、0.174±0.024，對照組為0.458±0.025；其中，吉非替尼組、聯(lián)合藥物組與對照組相比，P均<0.05；吉非替尼組、聯(lián)合藥物組內(nèi)各濃度組間相比，P均<0.05；C2、C3、C4、C5組與相同濃度的A2、A3、A4、A5組和B2、B3、B4、B5組相比，P均<0.05。②A1、A2、A3、A4、A5組細胞培養(yǎng)48 h時的OD值分別為0.541±0.010、0.453±0.016、0.396±0.011、0.344±0.014、0.261±0.011,B1、B2、B3、B4、B5組分別為0.688±0.035、0.687±0.018、0.677±0.018、0.641±0.036、0.556±0.019,C1、C2、C3、C4、C5組分別為0.526±0.033、0.431±0.019、0.376±0.027、0.296±0.022、0.209±0.027,對照組為0.684±0.019；其中，吉非替尼組、B3組、B4組、B5組、聯(lián)合藥物組與對照組相比，P均<0.05；吉非替尼組、華蟾素組、聯(lián)合藥物組內(nèi)各濃度組間相比，P均<0.05；聯(lián)合藥物組與相同濃度的吉非替尼組、華蟾素組相比，P均<0.05。③A1、A2、A3、A4、A5組細胞培養(yǎng)72 h時的OD值分別為0.755±0.021、0.590±0.024、0.499±0.023、0.353±0.022、0.267±0.005,B1、B2、B3、B4、B5組分別為1.088±0.176、0.990±0.085、0.849±0.038、0.758±0.050、0.704±0.041,C1、C2、C3、C4、C5組分別為0.714±0.033、0.481±0.036、0.383±0.026、0.310±0.006、0.232±0.011,對照組為1.089±0.190；吉非替尼組、華蟾素組、聯(lián)合藥物組與對照組相比，P均<0.05；吉非替尼組、華蟾素組、聯(lián)合藥物組內(nèi)各濃度組間相比，P均<0.05；聯(lián)合藥物組與相同濃度的吉非替尼組、華蟾素組相比，P均<0.05。各組細胞培養(yǎng)24、48、72 h時，相同濃度組間相比，P均<0.05。

2.2 A5、B5、C5、對照組細胞凋亡率比較 A5、B5、C5、對照組細胞培養(yǎng)48 h時的凋亡率分別為14.37%±0.48%、9.76%±0.37%、35.01%±0.62%、4.13%±0.65%，組間相比，P均<0.01。

2.3 A5、B5、C5、對照組細胞c-met蛋白相對表達量比較 A5、B5、C5、對照組細胞中c-met蛋白的相對表達量分別為0.477±0.034、0.629±0.007、0.332±0.010、0.738±0.023，組間相比，P均<0.001。

3 討論

目前所發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤中，肺癌患病及致死率均居第一，由于肺癌早期缺乏典型臨床癥狀，很難做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。據(jù)統(tǒng)計，進展期的肺癌5年生存率不足15%[10]。據(jù)有關(guān)文獻[11]報道，2015年我國肺癌發(fā)病和死亡人數(shù)分別為73萬例和61萬例。在治療肺癌期間，中草藥的輔助治療在減輕患者臨床癥狀、改善生活質(zhì)量及延長生存期方面有明顯優(yōu)勢，并越來越多的在相關(guān)領(lǐng)域受到關(guān)注[12]。華蟾素主要成分為蟾素內(nèi)酯，具有很強的抗癌活性，對腫瘤細胞有很強的殺傷和抑制作用。現(xiàn)已報道，華蟾素在肝癌[13]、前列腺癌[14]、胃癌[15]等多種癌癥中可發(fā)揮抗腫瘤效果。熊飛等[16]發(fā)現(xiàn)，華蟾素可顯著抑制裸鼠的肺癌A549移植瘤生長，與抑制腫瘤細胞生長、促進其凋亡有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，華蟾素單獨作用于肺癌A549細胞后有明顯的增殖抑制效果，并隨著時間的延長而升高；在聯(lián)合吉非替尼后，增值率也明顯低于吉非替尼組，說明華蟾素對肺癌A549細胞是有增殖抑制作用的，且在聯(lián)合吉非替尼時也起到一定的增效作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，華蟾素可促進肺癌A549細胞的凋亡，在聯(lián)合用藥后，細胞凋亡率明顯高于任一單獨用藥組，說明華蟾素能顯著提高肺癌A549細胞對吉非替尼的敏感性，同時增強了吉非替尼的抗腫瘤活性，從而促進肺癌A549細胞凋亡。

EGFR是一種廣泛表達的酪氨酸激酶生長因子受體，其在表皮生長因子介導的下游信號通路的過度表達和異常激活與各種上皮源性腫瘤的發(fā)病機制密切相關(guān)[17]。經(jīng)典的EGFR信號通路主要依賴于其酪氨酸激酶活性，在EGF等配體的指導下，EGFR通過自身的二聚或與其他家族成員的相互作用而被激活。激活的EGFR通過激活Ras-Raf-MEK-ERK1/2、PI3-K-Akt-mTOR、JAK2-STAT3和PLC-γ-PKC-IKK等途徑參與一系列腫瘤細胞惡性表型的調(diào)節(jié)[18]。EGFR擴增和異常激活是NSCLC常見的分子事件，因此，在NSCLC的臨床治療中應(yīng)用了以EGFR為靶點的受體酪氨酸激酶抑制劑，如吉非替尼和厄洛替尼[19]。EGFR-TKIs已上市近10年，對EGFR突變的NSCLC患者具有良好的臨床療效，但頻繁的耐藥限制了其進一步的應(yīng)用[20]。EGFR-TKIs如吉非替尼的耐藥主要由于異常突變激活下游的表皮生長因子受體信號通路Ras-Raf-MEK-ERK1/2 PI3-K-Akt-mTOR,或由于繼發(fā)性耐藥如c-met過表達等二級EGFR基因突變,使得EGFR靶向治療受到極大地限制[21]。c-met是肝細胞生長因子(HGF)的受體。研究[22]表明，c-met的高表達可以激活腫瘤細胞中多種信號通路，促進腫瘤的生存和生長。c-met通路是誘導肺癌細胞對吉非替尼耐藥的重要機制，因此，輔助靶向治療降低c-met過表達已成為提高抗腫瘤藥物療效的重要策略[23]。有研究[24]顯示，華蟾素可以抑制HGF/c-met通路蛋白的表達，抑制荷瘤小鼠肝癌的生長。本研究表明，在c-met蛋白表達上，華蟾素單藥及聯(lián)合用藥均可使其蛋白表達降低，其中聯(lián)合用藥組與吉非替尼組存在顯著差異。

綜上所述，與單獨應(yīng)用吉非替尼或華蟾素相比，華蟾素聯(lián)合吉非替尼可抑制人非小細胞肺腺癌細胞株A549等增殖，促進其凋亡；華蟾素聯(lián)合吉非替尼可通過下調(diào)c-met蛋白表達來發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，因華蟾素能幫助吉非替尼降低對c-met的表達，我們推測華蟾素可在一定程度上延緩肺癌細胞對吉非替尼耐藥的發(fā)生。這些研究為吉非替尼等EGFR酪氨酸激酶抑制劑的靶向治療增效及尋求延長耐藥的方法提供了新的策略和思路。