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        宮頸癌組織中SALL3、DNMT3A、甲基化SALL3基因表達觀察

        2019-03-13 13:53:22趙娟魏星楊婷趙敏伊楊筱鳳
        山東醫(yī)藥 2019年36期
        關鍵詞:甲基化宮頸癌宮頸

        趙娟,魏星,楊婷,趙敏伊,楊筱鳳

        (1 西安交通大學第一附屬醫(yī)院,西安710061;2 西安交通大學第二附屬醫(yī)院)

        宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。研究[1]顯示,我國每年新發(fā)病例數(shù)達13.1萬,死亡例數(shù)達5.3萬,占所有女性惡性腫瘤的18%。近年來,宮頸癌新的診斷和治療技術得到不斷發(fā)展,但患者的5年總體生存率僅在40%左右,因此明確宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機制,尋找宮頸癌早期診斷指標及治療方案具有重要的臨床意義[2]。研究[3]表明,表觀遺傳學調(diào)控如甲基化、乙?;?、糖基化等,參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。DNA甲基化修飾在基因表達調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用,DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化下,以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體,使CpG島中5′端胞嘧啶甲基化,而CpG島多位于基因啟動子附近,因此DNA甲基化后將抑制基因轉(zhuǎn)錄。DNMT家族包括DNA甲基化維持酶(DNMT1)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)3個成員,在DNA甲基化的啟動和維持中發(fā)揮重要作用。研究[4]顯示,DNMT3A在多種腫瘤中高表達,可通過直接或協(xié)同作用導致抑癌基因異常甲基化而沉默其表達。spalt樣轉(zhuǎn)錄因子3(SALL3)是SAL基因家族的成員,位于染色體18q23,SALL3基因編碼產(chǎn)生含有4個鋅指結構的轉(zhuǎn)錄因子。研究[5]顯示,SALL3基因啟動子在腫瘤發(fā)生時存在異常甲基化現(xiàn)象,導致SALL3基因表達水平降低。研究[6]發(fā)現(xiàn),SALL3能通過雙鋅指結構域與DNMT3A的PWWP結構域結合,抑制DNMT3A,而在腫瘤發(fā)生時SALL3表達降低,導致抑制DNMT3A能力下降,DNMT3A活性增強后進而抑制抑癌基因的表達,促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前有關宮頸癌中SALL3及DNMT3A表達的研究較少。本研究觀察了宮頸癌組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA及甲基化SALL3基因表達情況,分析SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表達的相關性及其與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關系,現(xiàn)報告如下。

        1 資料與方法

        1.1 臨床資料 選取2016年12月~2018年12月西安交通大學第一附屬醫(yī)院診治的宮頸癌患者200例,患者年齡27~56歲,平均(42.9±7.1)歲,其中宮頸鱗癌161例、子宮腺癌39例,腫瘤高分化57例、中分化65例、低分化78例,腫瘤分期Ⅰ期112例、Ⅱ期88例[7],淺肌層浸潤81例、深肌層浸潤119例,淋巴結轉(zhuǎn)移117例、無淋巴結轉(zhuǎn)移83例。納入標準:①均經(jīng)宮頸活檢病理或術后病理檢查確診為宮頸癌;②均為初次診治,既往未接受其它抗腫瘤治療;③臨床病理資料完整,患者及家屬均知情同意并已簽署知情同意書。排除標準:①合并其它器官系統(tǒng)的惡性腫瘤;②合并急性感染性疾病,如上呼吸道感染等;③合并嚴重的臟器功能不全,如心功能衰竭、肝功能衰竭等。選取同期接受手術治療的子宮肌瘤患者40例,患者年齡34~56歲,平均(42.1±6.8)歲。本研究中,200例宮頸癌患者與40例子宮肌瘤患者年齡間無顯著差異(P>0.05)?;颊呔邮苁中g切除治療,宮頸癌患者術中留取宮頸癌組織,子宮肌瘤患者術中留取正常宮頸組織,留取的組織標本迅速置于凍存管內(nèi),液氮速凍后,置于-80℃冰箱保存。

        1.2 宮頸癌組織及正常宮頸組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA檢測方法 采用qRT-PCR法。取約30 mg組織標本,TRIzol法提取總RNA,溶于80 μL無RNA酶的ddH2O中,核酸蛋白測定儀上檢測RNA濃度。以2 μg總RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,總反應體系為20 μL,實驗步驟嚴格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。以cDNA為模板,進行熒光定量PCR反應。引物序列如下:SALL3正向引物為5′-CCAATGTGTCGGTGTTCGAG-3′,反向引物為5′-CCGGGTAAGGGTTCATCTGG-3′;DNMT3A正向引物為5′-CCGATGCTGGGGACAAGAAT-3′,反向引物為5′-CCCGTCATCCACCAAGACAC-3′;內(nèi)參基因GAPDH正向引物為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,反向引物為3′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-5′。熒光定量PCR反應條件為:94 ℃ 4 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s,40個循環(huán)。所有反應均在ABI實時定量PCR儀上完成,每個樣本重復3次。以2-ΔCt表示目的基因的相對表達量。

        1.3 宮頸癌組織及正常宮頸組織中甲基化SALL3基因表達觀察 應用酚-氯仿法提取、純化組織DNA,實驗步驟按照TaKaRa Mini DNA 提取試劑盒說明書進行,瓊脂糖凝膠電泳鑒定。應用亞硫酸氫鈉修飾提取的500 ng基因組DNA,以將DNA中尚未甲基化的胞嘧啶(C)修飾為尿嘧啶(U),操作步驟按照EZ DNA Methylation-Gold Kit說明書進行,然后進行甲基化特異PCR擴增。引物序列如下:SALL3基因甲基化正向引物:5′-ATTTTAGAATGGAAGGGAGTTCGTC-3′,反向引物:5′-ATAACCTCCTAAAACTTCCCCGAA-3′;SALL3基因非甲基化正向引物:5′-ATTTTAGAATGGAAGGGAGTTTGTTG-3′,反向引物:5′-AAATAACCTCCTAAAACTTCCCCAAA-3′。PCR反應體系根據(jù)PCR反應試劑盒說明進行。PCR反應條件為:95 ℃預變性10 min;然后進行40個循環(huán)的擴增反應,程序為95 ℃變性30 s,51 ℃退火60 s,72 ℃延伸30 s;72 ℃延伸8 min,4 ℃保溫。PCR反應結束后取10 μL反應產(chǎn)物,應用2%瓊脂糖凝膠進行電泳,以去離子水為陰性對照,應用成像分析系統(tǒng)照相,根據(jù)DNA條帶判斷結果。甲基化陽性結果判斷方法:甲基化引物擴增出目的條帶,而非甲基化引物未擴增出目的條帶;甲基化陰性結果判斷方法:甲基化引物未擴增出目的條帶,而非甲基化引物擴增出目的條帶。用圖像分析系統(tǒng)計算受檢標本的甲基化條帶密度值,即為標本的相對甲基化程度。

        2 結果

        2.1 宮頸癌組織與正常宮頸組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表達比較 宮頸癌組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA相對表達量分別為0.253±0.051、0.272±0.055,正常宮頸組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA相對表達量分別為1.050±0.062、0.093±0.016,兩者相比,P均<0.05。

        2.2 宮頸癌組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表達的相關性 宮頸癌組織中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表達呈負相關(r=-0.679,P=0.000)。

        2.3 SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表達與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關系 結果見表1。表1顯示,SALL3、DNMT3A mRNA表達與宮頸癌患者FIGO分期、分化程度有關(P均<0.05)。

        2.4 宮頸癌組織及正常宮頸組織中甲基化SALL3基因比較 宮頸癌組織中SALL3基因甲基化率為60.5%(121/200),相對甲基化程度為1.72±0.61;正常宮頸組織中SALL3基因甲基化率為30.0%(12/40),相對甲基化程度為0.26±0.07;兩者相比,P均<0.05。

        3 討論

        DNA甲基化是表觀遺傳修飾的最常見形式,通過基因表達調(diào)控,參與各種分化發(fā)育、炎癥、自身免疫和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。研究[8]表明,啟動子區(qū)域特別是CpG島異常的DNA甲基化與許多癌癥的發(fā)生密切相關。在結直腸癌研究[9]中發(fā)現(xiàn),β-環(huán)連蛋白抑制基因2(DACT2)為一種抑癌基因,其基因啟動子區(qū)域存在高甲基化的現(xiàn)象,DACT2表達降低可能參與了結直腸癌的發(fā)生發(fā)展,而DNA高甲基化是DACT2的重要表達調(diào)控機制。此外,研究[10]發(fā)現(xiàn),谷胱甘S-轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)保護細胞避免DNA損傷和癌細胞形成,GSTP1基因啟動子甲基化可能造成GSTP1基因低表達,GSTP1活性降低導致DNA損傷的敏感性增強和癌變發(fā)生的概率增加。因此,腫瘤相關基因的異常甲基化在致癌過程中起重要作用,研究宮頸癌中特異性基因甲基化具有重要意義。

        表1 SALL3、DNMT3A mRNA表達與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關系

        SALL3是SAL家族的成員,其參與人類多個系統(tǒng)的發(fā)育過程,該基因表達缺失患者表現(xiàn)為先天性心臟疾病、精神發(fā)育遲滯、生長發(fā)育遲緩及肢體畸形等。近年來研究[11]表明,SALL3表達水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間關系密切,在肝細胞癌中,SALL3基因啟動子被DNA甲基化修飾,SALL3高甲基化降低了肝細胞癌中SALL3的表達水平,SALL3的異常高甲基化有助于肝細胞癌的發(fā)生。本研究中,宮頸癌組織中SALL3基因表達在mRNA水平上明顯低于正常宮頸組織,表明宮頸癌組織中SALL基因表達降低。進一步分析發(fā)現(xiàn),宮頸癌組織中SALL3 mRNA表達與FIGO分期、腫瘤分化程度有關,F(xiàn)IGO分期越高、分化越低的癌組織中SALL3 mRNA相對表達量越低,表明SALL3 mRNA相對表達量能夠反映宮頸癌病情嚴重程度,有望成為新的腫瘤相關標志物。我們認為,其機制可能是隨著腫瘤進展,腫瘤微環(huán)境中IL-7等細胞因子結合細胞表面的IL-7Rα,進而抑制轉(zhuǎn)錄因子SALL3的表達[12]。此外,SALL基因啟動子區(qū)域存在表觀遺傳學修飾的現(xiàn)象,也可降低SALL3基因表達。Yu等[13]在膀胱癌患者尿液中脫落的腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)SALL3富含CG的啟動子區(qū)域高度甲基化,認為SALL3可能是檢測膀胱癌的新型DNA甲基化標記物。本研究進一步檢測SALL3基因甲基化表達情況,結果顯示宮頸癌組織中SALL3基因甲基化率及相對甲基化程度均顯著高于正常宮頸組織,表明SALL3基因的表觀遺傳學修飾可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,特別是腫瘤的早期階段,因而檢測SALL3基因甲基化情況有可能成為宮頸癌的早期診斷方法。目前SALL3基因異常高甲基化的機制尚不清楚,可能與HPV感染有關。有研究[14]報道,在宮頸癌SiHa、HeLa兩種HPV陽性細胞系中均存在SALL3基因啟動子區(qū)域中高甲基化的現(xiàn)象,但在HPV陰性細胞系C33A中SALL3基因在啟動子區(qū)域未出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象,因而HPV的感染可能參與誘導SALL3基因甲基化,參與相關的致癌機制。

        DNMT3A基因編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,是甲基化調(diào)節(jié)的關鍵酶,參與從頭甲基化過程,DNMT3A蛋白定位于細胞質(zhì)和細胞核。有研究[15]表明,DNMT3A與異染色質(zhì)的組分相互作用,包括HP1、HDAC和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,在染色質(zhì)結構的調(diào)節(jié)中起重要作用。研究[16]發(fā)現(xiàn),DNMT3A基因突變參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,在25%的急性髓性白血病(AML)患者中常發(fā)生DNMT3A基因R882位點突變。本研究中,宮頸癌組織中DNMT3A在mRNA相對表達量上表達明顯高于正常宮頸組織,且宮頸癌組織中DNMT3A mRNA表達與FIGO分期、腫瘤分化程度有關,F(xiàn)IGO分期越高、分化越低的癌組織中DNMT3A mRNA相對表達量越高,提示宮頸癌組織中DNMT3A mRNA表達升高可能參與宮頸癌的病情發(fā)展。DNMT3A表達升高的機制尚不清楚,可能與宮頸癌組織中SALL3基因高甲基化后SALL3表達降低,導致SALL3對DNMT3A的抑制作用減弱,DNMT3A的表達上調(diào)后促進抑癌基因的從頭甲基化,促進了宮頸癌的發(fā)生[13]。本研究中,SALL3與DNMT3A mRNA表達呈顯著負相關,表明兩者可能存在相互作用,有待進一步深入研究。

        綜上所述,宮頸癌組織中SALL3 mRNA低表達、DNMT3A mRNA高表達,兩者負相關,SALL3、DNMT3A mRNA表達與宮頸癌FIGO分期、分化程度有關,兩者共同參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程,有希望成為新的診斷、治療及預后評估的腫瘤標志物。宮頸癌組織中SALL3基因甲基化率及相對甲基化程度升高,檢測甲基化SALL3基因情況有可能成為宮頸癌的早期診斷方法。

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