思蘭蘭，李樂(lè)，陳容娟，柏兆方，牛明，王伽伯，蘭金初，徐東平，劉妍

(1 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心，北京100039；2 北京市鼓樓中醫(yī)醫(yī)院)

乙型肝炎病毒(HBV)感染相關(guān)疾病嚴(yán)重危害人類健康，持續(xù)病毒復(fù)制增加了肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。目前臨床上治療HBV感染的藥物主要有干擾素和核苷(酸)類似物(NAs)。這些藥物給患者帶來(lái)益處的同時(shí)也存在局限性。研究[1]顯示，干擾素需要注射，副作用大且僅有約30%的乙肝患者對(duì)其敏感。臨床上廣泛應(yīng)用的口服抗病毒藥NAs不能清除HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)[2]，因此需要長(zhǎng)期服藥，而隨之產(chǎn)生的病毒耐藥問(wèn)題也是當(dāng)前困擾臨床的難題[3]。研究者一直在努力探索更多安全有效的抗HBV藥物和方法，除了開(kāi)發(fā)更新型的化學(xué)藥物，許多中草藥也被發(fā)現(xiàn)具有抗HBV作用[4～6]。這些中草藥中含有的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型包括黃酮類、苯丙素類、萜類、生物堿、醌類和多糖等，與目前臨床上應(yīng)用的以NAs為主的抗HBV藥物的單一結(jié)構(gòu)類型相比，更具多樣性，抗病毒的機(jī)制也各不相同，這不僅有助于開(kāi)發(fā)抗HBV新藥，并且對(duì)發(fā)展聯(lián)合用藥、提高療效、減小副作用和耐藥突變的發(fā)生都有重要意義[7,8]。本課題組前期研究[9,10]表明，新型中藥復(fù)方制劑肅毒星可通過(guò)多分子、多靶點(diǎn)、多通路的方式抑制HBV復(fù)制。肅毒星的成分分析顯示，其含有氧化苦參堿、苦參堿、黃芩素、漢黃芩素等25種主要成分，其中黃芩素和漢黃芩素單獨(dú)使用及聯(lián)合使用都有很好的抗野生HBV和恩替卡韋(ETV)耐藥HBV的作用。本研究觀察了黃芩素、漢黃芩素及其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)ETV耐藥HBV的抑制作用及最佳配比，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 黃芩素、漢黃芩素藥物濃度選擇及細(xì)胞分組 采用CCK8法觀察黃芩素、漢黃芩素對(duì)ETV耐藥HBV的毒性作用。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2.A64細(xì)胞[11]以每孔2×104個(gè)接種于96孔板，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，分別單獨(dú)加入不同濃度的黃芩素(0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μmol/L)和漢黃芩素(0.75、1.5、3、6、12、24、48、96、192、384 μmol/L)，記為實(shí)驗(yàn)組。隔天換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)96 h后，每孔加入10 μL CCK8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h。以空白孔為空白組，以不加藥物的孔為對(duì)照組，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)在波長(zhǎng)450 nm處各孔的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。結(jié)果顯示，黃芩素在16 μmol/L、漢黃芩素在12 μmol/L時(shí)的細(xì)胞存活率大于90%，故本研究選擇黃芩素的最高濃度為16 μmol/L、漢黃芩素的最高濃度為12 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取HepG2.A64細(xì)胞，分為黃芩素組、漢黃芩素組、聯(lián)用藥物組和對(duì)照組。黃芩素組分別加入4、8、16 μmol/L的黃芩素，記為B4、B8、B16組。漢黃芩素組分別加入3、6、12 μmol/L的漢黃芩素，記為W3、W6、W12組。聯(lián)用藥物組的第一部分分別加入相同濃度(4 μmol/L)的黃芩素及不同濃度(3、6、12 μmol/L)的漢黃芩素，記為B4+W3、B4+W6、B4+W12組；聯(lián)用藥物組的第二部分分別加入相同濃度(8 μmol/L)的黃芩素及不同濃度(3、6、12 μmol/L)的漢黃芩素，記為B8+W3、B8+W6、B8+W12組；聯(lián)用藥物組的第三部分分別加入相同濃度(16 μmol/L)的黃芩素及不同濃度(3、6、12 μmol/L)的漢黃芩素，記為B16+W3、B16+W6、B16+W12組。對(duì)照組加入等量DMEM培養(yǎng)基。

1.2 各組細(xì)胞上清HBV DNA、HBsAg檢測(cè) 取各組細(xì)胞以0.5×105/孔鋪種于48孔板，繼續(xù)培養(yǎng)96 h后，收集細(xì)胞上清。①采用PCR-熒光探針“一管法”檢測(cè)細(xì)胞上清HBV DNA。按照乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行定量PCR反應(yīng)體系配制：細(xì)胞上清3 μL+核酸釋放劑3 μL+PCR-mix 32 μL，吹打混勻3～5次，瞬時(shí)離心，然后使用SLAN96P熒光定量檢測(cè)儀定量檢測(cè)HBV DNA滴度。擴(kuò)增程序?yàn)椋?7 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、61 ℃ 30s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算細(xì)胞上清HBV DNA抑制率。細(xì)胞上清HBV DNA抑制率=100%-(各組細(xì)胞上清HBV DNA滴度/對(duì)照組細(xì)胞上清HBV DNA滴度)×100%。②采用雙抗體夾心法檢測(cè)細(xì)胞上清HBsAg。取細(xì)胞上清50 μL，加入預(yù)先包被好的酶聯(lián)板，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔、陰性對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔，每孔分別加入酶結(jié)合物50 μL(空白對(duì)照孔不加)混勻，貼上不干膠條，37 ℃孵育60 min，洗板5次，然后加入顯色液，37 ℃孵育15 min顯色，最后加入終止液終止顯色反應(yīng)，使用Synergy H4全功能酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞上清HBsAg抑制率。細(xì)胞上清HBsAg抑制率=100%-(各組細(xì)胞上清HBsAg的OD值/對(duì)照組細(xì)胞上清HBsAg的OD值)×100%。

1.3 各組細(xì)胞內(nèi)HBV總DNA和HBV cccDNA的檢測(cè) 取各組細(xì)胞以1.5×105/孔鋪種于12孔板，繼續(xù)培養(yǎng)96 h后，收集培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，收集時(shí)每孔細(xì)胞計(jì)數(shù)需要達(dá)到3×105～5×105個(gè)。按照QIAamp DNA Mini Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總DNA，PSAD酶消化，按照95 ℃ 3 min、50 ℃ 15 s、30 ℃ 15 s、20 ℃ 10 min的程序進(jìn)行跨缺口滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)[12]。引物序列如下：RCA1正向引物為5′-AATCCTCACAATACC-3′，RCA1反向引物為5′-ACCTATTCTCCTCCC-3′；RCA2正向引物為5′-CCTATGGGAGTGGGC-3′，RCA2反向引物為5′-CCTTTGTCCAAGGGC-3′；RCA3正向引物為5′-ATGCAAC TTTTTCAC-3′，RCA3反向引物為5′-CTAGCAGAGCTTGGT-3′；RCA4正向引物為5′-TAGAAGAAGAACTCC-3′，RCA4反向引物為5′-GGGCCCACATATTGT-3′。以RCA擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBV總DNA、HBV cccDNA的拷貝數(shù)[13]。反應(yīng)條件：60 ℃ 10 s，94 ℃ 3 min、94 ℃ 15 s、58 ℃ 45 s(40個(gè)循環(huán))。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)HBV總DNA、HBV cccDNA的拷貝數(shù)，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)HBV總DNA抑制率。細(xì)胞內(nèi)HBV總DNA抑制率=100%-(各組HBV總DNA拷貝數(shù)/對(duì)照組HBV總DNA拷貝數(shù))×100%。細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA抑制率=100%-(各組HBV cccDNA拷貝數(shù)/對(duì)照組HBV cccDNA拷貝數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞上清HBV DNA抑制率比較 B4、B8、B16、W3、W6、W12、B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12、對(duì)照組細(xì)胞上清HBV DNA抑制率分別為29.01%±3.60%、61.79%±0.09%、73.59%±2.65%、30.45%±1.26%、62.65%±0.05%、67.22%±3.93%、49.81%±1.36%、63.87%±4.01%、73.64%±0.29%、70.05%±1.15%、70.99%±0.42%、79.16%±1.54%、79.18%±0.53%、80.57%±1.60%、83.00%±2.31%、0。黃芩素組、漢黃芩素組、聯(lián)用藥物組細(xì)胞上清HBV DNA抑制率與對(duì)照組相比，P均<0.05；聯(lián)用藥物組細(xì)胞上清HBV DNA抑制率與相同藥物濃度的黃芩素組、漢黃芩素組相比，P均<0.05。聯(lián)用藥物組B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12的Q值分別為0.884、0.869、0.960、0.954、0.828、0.905、0.970、0.894、0.909，其中B8+W6組表現(xiàn)為拮抗作用，其余各組均為相加作用。Q值最大的B16+W3組藥物濃度為最佳的作用配比，最佳作用配比大約為5∶1。

2.2 各組細(xì)胞上清HBsAg抑制率比較 B4、B8、B16、W3、W6、W12、B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12、對(duì)照組細(xì)胞上清HBsAg抑制率分別為20.46%±0.92%、30.52%±6.59%、39.46%±2.63%、14.13%±2.90%、26.42%±4.74%、38.53%±1.32%、19.87%±0.13%、23.81%±1.32%、36.29%±5.01%、26.56%±1.15%、27.44%±0.66%、48.68%±3.29%、42.55%±2.30%、39.37%±1.19%、52.87%±3.42%、0。黃芩素組、漢黃芩素組、聯(lián)用藥物組細(xì)胞上清HBsAg抑制率與對(duì)照組相比，P均<0.05；聯(lián)用藥物組細(xì)胞上清HBsAg抑制率與相同藥物濃度的黃芩素組、漢黃芩素組相比，其中B8+W12組與B8組、W12組相比，B16+W3組與B16組、W3組相比，B16+W12組與B16組、W12組相比，P均<0.05；其余聯(lián)用藥物組與相同藥物濃度的黃芩素組、漢黃芩素組相比，P均>0.05。聯(lián)用藥物組B8+W12、B16+W3、B16+W12的Q值分別為0.850、0.886、0.842，其中B8+W12、B16+W3組為相加作用，B16+W12組為拮抗作用。Q值最大的B16+W3組藥物濃度為最佳的作用配比，最佳作用配比大約為5∶1。

2.3 各組細(xì)胞內(nèi)HBV總DNA抑制率比較 B4、B8、B16、W3、W6、W12、B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12、對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)HBV總DNA抑制率分別為28.14%±0.44%、44.89%±0.81%、58.70%±7.36%、13.50%±0.63%、43.61%±0.89%、68.08%±1.62%、37.89%±0.36%、60.41%±3.27%、67.03%±1.67%、58.94%±0.32%、64.47%±5.54%、73.68%±7.53%、76.05%±2.68%、80.47%±2.18%、87.97%±1.24%、0。黃芩素組、漢黃芩素組、聯(lián)用藥物組細(xì)胞內(nèi)HBV總DNA抑制率與對(duì)照組相比，P均<0.05；聯(lián)用藥物組細(xì)胞內(nèi)HBV總DNA抑制率與相同藥物濃度的黃芩素組、漢黃芩素組相比，P均<0.05。聯(lián)用藥物組B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12的Q值分別為1.001、1.016、0.870、1.126、0.935、0.894、1.183、1.049、1.013，其中B16+W3組表現(xiàn)為協(xié)同作用，其余各組均為相加作用。Q值最大的B16+W3組藥物濃度為最佳的作用配比，最佳作用配比大約為5∶1。

2.4 各組細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA抑制率比較 B4、B8、B16、W3、W6、W12、B4+W3、B4+W6、B4+W12、B8+W3、B8+W6、B8+W12、B16+W3、B16+W6、B16+W12、對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA抑制率分別為31.06%±2.89%、47.86%±6.79%、54.67%±3.92%、43.84%±2.11%、54.84%±1.78%、68.86%±2.80%、55.00%±3.30%、31.66%±1.40%、34.05%±4.85%、65.12%±3.41%、49.39%±0.95%、44.42%±2.36%、72.42%±4.71%、68.15%±2.46%、72.05%±0.34%、0。黃芩素組、漢黃芩素組、聯(lián)用藥物組細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA抑制率與對(duì)照組相比，P均<0.05；聯(lián)用藥物組細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA抑制率與相同藥物濃度的黃芩素組、漢黃芩素組相比，其中B16+W3組與B16組、W3組相比，B16+W6組與B16組、W6組相比，B16+W12組與B16組、W12組相比，P均<0.05；其余聯(lián)用藥物組與相同藥物濃度的黃芩素組、漢黃芩素組相比，P均>0.05。聯(lián)用藥物組B16+W3、B16+W6、B16+W12的Q值分別為0.972、0.857、0.839，其中B16+W3、B16+W6組為相加作用，B16+W12組為拮抗作用。Q值最大的B16+W3組藥物濃度為最佳的作用配比，最佳作用配比大約為5∶1。

3 討論

近年來(lái)，隨著抗病毒治療技術(shù)的不斷發(fā)展，聯(lián)合抗病毒治療已經(jīng)成為臨床常用的一種HBV治療方案，且聯(lián)合治療顯示出一定的優(yōu)勢(shì)。我們前期研究[10]發(fā)現(xiàn)，黃芩素和漢黃芩素是新型中藥復(fù)方抗病毒制劑——肅毒星注射液中的兩種主要組成成分，這兩種化合物單獨(dú)或以1∶2的比例聯(lián)合應(yīng)用對(duì)野生型HBV及ETV耐藥HBV有很好的抑制作用。黃芩素，也叫黃芩黃素或黃芩苷元，是從黃芩根中提取的一種具有生物活性的黃酮類化合物。近年越來(lái)越多的研究[10,15]發(fā)現(xiàn)，黃芩素具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、保護(hù)肝臟、保護(hù)心腦血管、抗炎、抗氧化、降血糖等多種生物學(xué)功能。漢黃芩素，也是從黃芩根中分離提取出來(lái)的一種黃酮類化合物，它是黃芩的主要有效成分之一。目前已有大量研究[10,16]證明，漢黃芩素具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化及抗HBV作用等功能。目前這兩個(gè)藥物聯(lián)合抗HBV的作用研究鮮見(jiàn)報(bào)道，同時(shí)兩種化合物對(duì)ETV耐藥HBV cccDNA的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在明確兩者聯(lián)合對(duì)ETV耐藥HBV作用的最佳聯(lián)合比例及其對(duì)HBV cccDNA的作用效果。

本研究選擇細(xì)胞存活率>90%的藥物濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了尋找最佳的聯(lián)合抗病毒作用比例，我們選擇4、8、16 μmol/L的黃芩素和3、6、12 μmol/L的漢黃芩素分別進(jìn)行兩兩聯(lián)合抗病毒實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果顯示，黃芩素組對(duì)HBV DNA、HBsAg作用的抑制率范圍分別為29.01%～73.59%、20.46%～39.46%，漢黃芩素組對(duì)HBV DNA、HBsAg作用的抑制率范圍分別為30.45%～67.22%、14.13%～38.53%，聯(lián)用藥物組對(duì)HBV DNA、HBsAg作用的抑制率范圍分別為49.81%～83.00%、19.87%～52.87%，聯(lián)合抑制作用的效果更明顯。Guo等[17]使用漢黃芩素對(duì)野生型HBV細(xì)胞株HepG2.2.15細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)2～5 μg/mL(約7～18 μmol/L)的漢黃芩素對(duì)HBsAg的抑制率為45%～60%，對(duì)HBV DNA的抑制率為30%～40%。我們單獨(dú)使用漢黃芩素對(duì)HBsAg抑制作用與之一致，對(duì)HBV DNA的抑制作用則優(yōu)于Guo的研究。以往對(duì)黃芩素、漢黃芩素抗HBV研究中未見(jiàn)對(duì)HBV總DNA、HBV cccDNA兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行過(guò)評(píng)價(jià)，本研究結(jié)果顯示，聯(lián)用藥物組對(duì)細(xì)胞內(nèi)HBV總DNA、HBV cccDNA的抑制效果較黃芩素組、漢黃芩素組好，我們的結(jié)果可為以后研究者探索這兩個(gè)藥物抗HBV總DNA、HBV cccDNA的作用提供很好的參考。

綜上所述，中藥復(fù)方制劑肅毒星的兩個(gè)重要組分黃芩素、漢黃芩素對(duì)ETV耐藥HBV有很好的抑制作用，且聯(lián)合用藥抑制作用優(yōu)于單獨(dú)用藥。同時(shí)，我們還首次證明黃芩素、漢黃芩素對(duì)HBV cccDNA有抑制作用，且聯(lián)合用藥的抑制作用較單獨(dú)用藥的抑制作用明顯。本研究結(jié)果對(duì)于強(qiáng)效NAs的長(zhǎng)期應(yīng)用帶來(lái)的耐藥問(wèn)題及HBV cccDNA清除的乙肝功能性治愈有著很好的臨床用藥參考價(jià)值和較好的臨床應(yīng)用前景。