萬 藝，方 妍

(福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002)

Bt Cry毒素與昆蟲中腸BBMV上的分子特異性結(jié)合是決定Cry毒素宿主范圍的重要因素。在結(jié)合試驗(yàn)中，利用BBMV以及被標(biāo)記的Cry毒素闡明了Cry毒素與昆蟲幼蟲中腸相互作用的特征。在過去的20年中，Bt研究者面臨的主要挑戰(zhàn)是識(shí)別與Cry毒素特異性結(jié)合的分子，并且推斷出該分子與Cry毒素功能的相關(guān)性。

1 鈣粘蛋白

鈣粘蛋白被普遍認(rèn)為是一種功能性的Cry蛋白受體，其與Cry毒素結(jié)合主要定位于中腸細(xì)胞的刷狀邊緣膜囊泡[1]。鈣粘蛋白也被發(fā)現(xiàn)錨定于煙草角蟲(Manducasexta)和舞毒蛾(Lymantriadispar)中腸上皮細(xì)胞底膜中[2]。一種名為BT-R1(Bt受體1)的鈣粘蛋白首次在煙草角蟲幼蟲中被鑒定為Cry毒素受體，研究表明，Cry1A毒素與Bt-R1具有高親和力，且在體外培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的Bt-R1對(duì)Cry1A毒素具有敏感性。鈣粘蛋白作為Cry1A毒素受體，其相關(guān)功能已經(jīng)在歐洲玉米螟(O.nubilalis)和煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)等昆蟲中被證實(shí)。與Cry1A蛋白耐藥性相關(guān)的鈣粘蛋白突變?cè)谠S多昆蟲中都有相關(guān)記錄，包括粉色棉鈴蟲、棉紅鈴蟲(Pectinophoragossypiella)、煙芽夜蛾。從甜菜夜蛾(Spodpteraexigua)中獲得部分鈣粘蛋白基因，克隆了鈣粘蛋白基因(SeCad1)的全開放閱讀框，通過RNA干擾甜菜夜蛾鈣粘蛋白的表達(dá)，揭示出鈣粘蛋白是Cry1Ca毒素的特異性靶分子，也說明鈣粘蛋白不僅為鱗翅目幼蟲Cry1A類毒素受體[3]。

鞘翅目昆蟲鈣粘蛋白也是Cry3Aa以及Cry3Bb毒素的功能受體。相關(guān)研究從黃粉蟲(Tenebriomolitor)幼蟲中腸mRNA中克隆了Cry3Aa受體鈣粘蛋白，并且預(yù)測(cè)蛋白TmCad1具有與鱗翅目鈣粘蛋白相似的結(jié)構(gòu)域和假定的毒素結(jié)合區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)TmCad1蛋白假定毒素結(jié)合區(qū)的肽段能與Cry3Aa毒素特異性結(jié)合并促進(jìn)Cry3Aa毒素低聚物的形成[4]。有研究從小粉蟲(Alphitobiusdiaperinus)幼蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個(gè)185kDa鈣粘蛋白(AdCad1)，其具有鈣粘蛋白的典型結(jié)構(gòu)成分，包括9個(gè)胞外重復(fù)序列(CR9)、一個(gè)近膜端胞外域(MPED)和一個(gè)胞質(zhì)區(qū)域。CR9和MPED區(qū)域的肽段能夠與Cry3Bb毒素高效結(jié)合，并顯著協(xié)同Cry3Bb毒素對(duì)抗小粉蟲幼蟲。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過RNAi使得AdCad1基因沉默，導(dǎo)致了雙子葉植物幼蟲對(duì)Cry3Bb的敏感性顯著降低，這些結(jié)果證明AdCad1是Cry3Bb毒素的功能性受體[5]。

在雙翅目昆蟲中，鈣粘蛋白被認(rèn)為是埃及伊蚊(Aedesaegypti)Cry11Aa與Cry11Ba毒素以及岡比亞瘧蚊(Anophelesgambiae)的Cry11Ba毒素的功能受體。盡管Cry4Ba毒素能與埃及伊蚊以及岡比亞瘧蚊的鈣粘蛋白結(jié)合，但相比與Cry11結(jié)合，Cry4Ba毒素的親和力更低，這解釋了埃及伊蚊幼蟲中RNA干擾鈣粘蛋白表達(dá)后，增加了幼蟲對(duì)Cry11Aa的耐受性，但對(duì)Cry4Ba的毒性沒有產(chǎn)生影響[6]。

2 氨肽酶

氨肽酶N(APN)為鋅化金屬蛋白酶超家族中的亞科。其通過GPI錨定在中腸刷狀緣膜囊泡，并從N端降解多肽序列，這是氨基酸共轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入上皮細(xì)胞的必要環(huán)節(jié)。大量鱗翅目昆蟲的氨肽酶N(APN)可以與天然Cry毒素結(jié)合。對(duì)鱗翅目APN類氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，將其分為7個(gè)家族，發(fā)現(xiàn)在已有表達(dá)數(shù)據(jù)的APN家族中，APN1家族基因在中腸組織中表達(dá)最高[7]。已知，Cry1毒素與中腸APNs之間的相互作用涉及對(duì)初級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)位點(diǎn)的識(shí)別，研究發(fā)現(xiàn)Cry蛋白和APN的互作與糖基化位點(diǎn)具有關(guān)系，在煙草夜蛾(Heliothisvirescens)和舞毒蛾(Lymantriadispar)中的N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)的氨肽酶N區(qū)域是CrylAc蛋白結(jié)合部位。Cry1Ac與煙草角蟲以及舞毒蛾的APNs結(jié)合具有糖依賴和非糖依賴部分，相關(guān)模型表明，凝集素結(jié)構(gòu)域III通過識(shí)別舞毒蛾APN上的GalNAc啟動(dòng)對(duì)接，在初級(jí)對(duì)接之后，發(fā)生更高的親和結(jié)構(gòu)域II結(jié)合機(jī)制，這對(duì)于殺蟲活性至關(guān)重要，Cry1Ac毒素還以不同于半乳糖作用方式識(shí)別了煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)中的APN[8]。斜紋夜蛾(Spodopteralitura)APN作為Cry1C結(jié)構(gòu)域II的loop 2和loop 3識(shí)別位點(diǎn)[9]。

在20世紀(jì)90年代，APN被證實(shí)為Cry1受體，因?yàn)锳PN制劑能夠增強(qiáng)Cry1誘導(dǎo)的細(xì)胞膜囊泡和膜雙層離子通道的形成。后續(xù)研究，轉(zhuǎn)基因果蠅中表達(dá)了煙草角蟲APN，使Cry1Ac對(duì)于果蠅幼蟲具有顯著的殺蟲活性，提供了Cry受體蛋白的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。由RNA干擾(RNAi)引起的斜紋夜蛾，小蔗螟(Diatraeasaccharalis)以及煙芽夜蛾中腸APNs基因沉默，證實(shí)了它們分別為Cry1C，Cry1Ab,以及Cry1Ac毒素的受體。另外，特異性APN的突變或表達(dá)下降與小蔗螟，煙草角蟲以及煙芽夜蛾對(duì)Cry1毒素的抗性有關(guān)。粉紋夜蛾(Trichoplusiani)對(duì)Cry1Ac抗性與兩個(gè)APN的差異變化有關(guān);抗性幼蟲中APN1表達(dá)顯著下調(diào)，APN6表達(dá)顯著上調(diào)。此外，在耐藥幼蟲中缺乏APN1蛋白與轉(zhuǎn)錄水平降低有關(guān)[10]。

APNs在Cry毒素滅蚊中的作用已引起廣泛關(guān)注。相關(guān)研究表明感染黃熱病的埃及伊蚊的Cry11Aa及Cry11Ba受體，以及感染瘧疾的岡比亞瘧蚊的Cry11Ba受體存在差異。A.aegypti和Anopheles中特異性APNs分別與Cry11Aa蛋白以及Cry11Ba蛋白結(jié)合，并且具有高親和力。有趣的是，在生物測(cè)定中，部分APN片段的存在提高了Cry幼蟲的死亡率[11]。一個(gè)來自功能受體的意外發(fā)現(xiàn)表明APN和毒素之間的相互作用是可逆的。RNAi引起的埃及伊蚊APN基因沉默導(dǎo)致其對(duì)Cry4Ba毒素的耐受性增強(qiáng)，證明APN為該毒素的的功能受體。

3 堿性磷酸酶

在鱗翅目、鞘翅目以及雙翅目的昆蟲幼蟲發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶(ALP)為Cry毒素結(jié)合的功能性受體。在含有Cry1Ac時(shí)，煙芽夜蛾和煙草角蟲幼蟲中腸蛋白的ALP酶活性降低，證實(shí)Cry1Ac與ALP之間存在互作。利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析檢測(cè)到Cry蛋白與來自煙草角蟲，煙芽夜蛾以及埃及伊蚊刷狀緣膜囊泡(BBMVs)上的ALPs進(jìn)行結(jié)合。結(jié)果與APN的情況相似，Cry1Ac與ALP的結(jié)合涉及到與GalNAc的相互作用。對(duì)于Cry1Ab，其與ALP最開始通過結(jié)構(gòu)域III的β-16區(qū)域相互作用，這一步對(duì)于與ALP結(jié)合以及對(duì)幼蟲的毒性是極其關(guān)鍵的。由RNAi引起的煙草角蟲幼蟲中APN和ALP基因沉默表明，與APN相比，與ALP結(jié)合對(duì)Cry1Ab的毒性更重要，而Cry1Ac更依賴APN[12]。在煙芽夜蛾，棉鈴蟲中ALP表達(dá)降低與對(duì)Cry1毒素的耐藥性之間的相關(guān)性進(jìn)一步證實(shí)了在鱗翅目幼蟲體內(nèi)的ALP與Cry毒素的作用。在雙翅目昆蟲中，A.aegypti和AnophelesBBMV上的ALP能夠與Cry11Aa毒素以及Cry11Ba毒素相互作用是其在體內(nèi)發(fā)揮毒性的關(guān)鍵步驟。此外，利用RNAi對(duì)埃及伊蚊ALP1基因沉默，確定其為Cry11Aa毒素以及Cry4Ba毒素的功能受體[13]。

4 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

昆蟲ABC蛋白家族與動(dòng)物體內(nèi)的多藥耐藥蛋白有關(guān)。節(jié)肢動(dòng)物ABC基因家族的比較基因組學(xué)以及ABC蛋白在外源生物和殺蟲劑中的轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)系已被詳細(xì)介紹[14]。ABCC2突變及其對(duì)Cry1A毒素的抗性之間的基因連鎖表明了ABCC2蛋白對(duì)Cry1毒素的作用模式。將耐藥位點(diǎn)分離到不同的菌株中，可以證明在煙芽夜蛾菌株中，鈣粘蛋白突變與缺乏Cry1Aa的結(jié)合有關(guān)，而ABCC2基因的失活突變與缺乏Cry1Ab和Cry1Ac結(jié)合有關(guān)。小菜蛾和粉蚊夜蛾的ABCC2相關(guān)位點(diǎn)的突變也會(huì)引起其對(duì)Cry1Ac產(chǎn)生抗性，為該蛋白在Cry1A毒素作用中的功能提供進(jìn)一步的支持。通過對(duì)家蠶(Bombyxmori)的研究，直接證實(shí)了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)Cry1A毒素作用的重要性，在研究中，將ABCC2蛋白外腔表面loop結(jié)構(gòu)插入一個(gè)酪氨酸使易感家蠶對(duì)Cry1Ab產(chǎn)生抗性[15]。此外，通過比較野生型和突變型ABCC2基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)，證明了酪氨酸的插入和ABCC2蛋白對(duì)Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Fa甚至相對(duì)不相關(guān)的Cry8Ca易感性起重要作用[16]。盡管這些研究闡明了ABCC2蛋白在Cry毒素作用中的關(guān)鍵作用，但目前還沒有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ABCC2與Cry毒素相互作用的機(jī)制。

5 其他Cry受體蛋白和分子

除上述受體外，還有其他物質(zhì)被研究報(bào)道為Cry毒素的結(jié)合分子和假定受體，包括煙草角蟲的糖脂，舞毒蛾的糖結(jié)合物，聚鈣蛋白家族成員，馬鈴薯葉甲(Leptinotarsadecemlineata)的一種ADAM金屬蛋白酶，赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)鈉溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體，岡比亞瘧蚊的淀粉酶和α-葡萄糖苷酶。油脂和Cry毒素相互作用最早在研究紅頭麗蠅(Calliphoravicina)蛹中提取的糖脂與Cry1A原核蛋白和與活性毒素的結(jié)合中發(fā)現(xiàn)。雖然發(fā)現(xiàn)了與糖脂結(jié)合的毒素，但這一證據(jù)沒有被廣泛考慮，可能是因?yàn)樯n蠅幼蟲通常不容易受到Cry1A毒素的影響。糖脂作為Cry毒素受體的功能證據(jù)來自于新秀麗小桿線蟲(Caenorhabditiselegans)對(duì)Cry5Ba的抗性研究，該研究也證實(shí)了從煙草角蟲中腸組織中提取的Cry1A毒素與糖脂特異性結(jié)合，即證明了Cry中毒中脂質(zhì)的作用[17]。糖脂與Cry毒素結(jié)構(gòu)域II相互作用形成Cry毒素低聚物的作用機(jī)制以被證實(shí)，然而，脂質(zhì)與Cry毒素相互作用與毒性的關(guān)系尚未得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)252 kDa的聚鈣蛋白家族成員能夠與Cry1A毒素結(jié)合并形成復(fù)合物，這種蛋白質(zhì)以低聚物的形式存在于昆蟲體內(nèi)，但它不干擾桑蠶幼蟲的活動(dòng)。Cry毒素和多鈣蛋白家族成員之間的相互作用也有報(bào)道。綜上所述，Cry毒素與中腸液中的脂質(zhì)或蛋白質(zhì)之間相互作用對(duì)隨后與中腸細(xì)胞受體結(jié)合具有十分重要的作用。

多種蛋白已經(jīng)被報(bào)道參與了L.decemlineata中Cry3A的毒性反應(yīng)，在這個(gè)系統(tǒng)中，BBMV蛋白對(duì)Cry3Aa的蛋白水解可以減少膜穿孔。然而，Cry3Aa結(jié)構(gòu)域II的loop 1與ADAM金屬蛋白酶的交互作用對(duì)毒素孔的形成具有重要作用[18]。此外，有研究利用蛋白組學(xué)以及結(jié)合Western blot雜交的方式，在煙芽夜蛾中發(fā)現(xiàn)能夠與Cry1Ac毒素結(jié)合的受體為V-ATP合成酶亞基A(V-ATP synthase subunit A)與肌動(dòng)蛋白[19]。

最近的研究發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)中具有特殊的四聚氰胺基因位點(diǎn)突變，導(dǎo)致H.armigera對(duì)Cry1Ac蛋白產(chǎn)生顯著的抗性，而Cry1Ac是中國種植的轉(zhuǎn)基因棉花生產(chǎn)的唯一一種Bt蛋白。因此，為了加強(qiáng)耐藥性管理，對(duì)四聚氰胺突變位點(diǎn)進(jìn)行主動(dòng)識(shí)別和跟蹤，基因組分析、基因編輯和分子監(jiān)測(cè)是十分必要的[20]。

6 展望

昆蟲對(duì)蘇云金桿菌產(chǎn)生抗性是Bt應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)害蟲防治的限制因素。在Bt毒素發(fā)揮殺蟲過程中與受體的互作是關(guān)鍵步驟，由于受體發(fā)生突變導(dǎo)致昆蟲對(duì)Cry毒素產(chǎn)生一定抗性，抗性機(jī)制主要是毒素與昆蟲BBMV上的受體蛋白結(jié)合能力的降低有關(guān)。明確不同Cry毒素與受體之間的作用機(jī)制有利于研發(fā)高效的Bt作物和Bt生物農(nóng)藥制劑，使得化學(xué)農(nóng)藥的使用量減少，有利于保持健康的生態(tài)環(huán)境，為我國農(nóng)林業(yè)害蟲的生物防治提供一種新的思路。