闞鈞，周瑞生，侯雪楠，白莎莎，黃海福，周岱翰，張恩欣

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405；2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；3 廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院)

中藥來(lái)源于天然動(dòng)植物，中醫(yī)中藥在抗腫瘤應(yīng)用方面顯示出了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，多種中藥提取物制成的中藥制劑如華蟾素注射液、鴉膽子油乳、參芪扶正注射液等在臨床抗腫瘤治療中取得了很好的療效。華蟾素注射液是以中華大蟾蜍的陰干全皮為主要原料，經(jīng)水提醇沉工藝制備而成。蟾蜍這味中藥在臨床腫瘤治療中應(yīng)用已久，其分泌物蟾酥及干燥表皮蟾皮均可入藥。經(jīng)現(xiàn)代中藥學(xué)成分分析，蟾酥及干蟾皮的化學(xué)成分主要有蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類、蟾毒色胺類及甾醇類化合物等[1]。沙蟾毒精是蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類化合物中的一種主要活性單體成分，在蟾酥中含量達(dá)1.5%～2%，且表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。有學(xué)者[2]對(duì)從蟾酥及蟾皮中分離得到的60余種蟾毒內(nèi)酯類化合物進(jìn)行抗腫瘤作用篩選，發(fā)現(xiàn)沙蟾毒精腫瘤抑制活性最顯著，在肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中均具有很好的抗腫瘤活性，引起了越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注?，F(xiàn)將沙蟾毒精抗腫瘤作用研究進(jìn)展綜述如下。

1 沙蟾毒精的發(fā)現(xiàn)、提取及藥代動(dòng)力學(xué)

20世紀(jì)80年代，國(guó)內(nèi)就有學(xué)者[3]發(fā)現(xiàn)蟾酥的某些成分具有抗腫瘤作用，同期也有國(guó)外學(xué)者對(duì)日本蟾蜍及越南蟾蜍進(jìn)行化學(xué)成分研究，直至20世紀(jì)90年代國(guó)內(nèi)才有關(guān)于中華大蟾蜍化學(xué)成分的文獻(xiàn)[4]報(bào)道發(fā)表。1993年，日本學(xué)者[5]從蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類化合物中分離出一種成分，將其命名為arenobufagin，并就其對(duì)心肌細(xì)胞鈉-鉀泵ATP酶的抑制作用進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)arenobufagin具有一定的強(qiáng)心作用，對(duì)鈉-鉀泵ATP酶抑制效果是烏本苷的3.5倍。此時(shí)期國(guó)內(nèi)有學(xué)者[6]繼續(xù)進(jìn)行蟾蜍化學(xué)成分的分離研究，并得到了更多的單體成分。2007年，國(guó)內(nèi)學(xué)者[7]進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，arenobufagin即為沙蟾毒精。

近年來(lái)，有研究[8]采用特征圖譜法測(cè)定不同產(chǎn)地干蟾皮的沙蟾毒精的含量，結(jié)果表明四川產(chǎn)地蟾皮的沙蟾毒精含量較高(大花皮、中黑皮、超大皮、棕褐色皮、小黑皮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是0.252 4%、0.158 4%、0.181 1%、0.125 8%、0.108 8%)，其次是江蘇產(chǎn)地的黑皮(0.227 5%)，進(jìn)一步表明沙蟾毒精在干蟾皮中具有較高的含量。李娟等[9]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定9種蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類化合物，測(cè)得沙蟾毒精的含量為0.32～0.83 mg/g，為沙蟾毒精含量的測(cè)定提供了思路和方法。陳瀛瀾等[10]發(fā)現(xiàn)，蟾酥鮮漿經(jīng)不同方法(日曬干燥、50 ℃真空干燥、50 ℃鼓風(fēng)干燥、80 ℃鼓風(fēng)干燥、冷凍干燥)炮制加工，其含有沙蟾毒精的含量并未有明顯差異，他們還指出50 ℃和80 ℃鼓風(fēng)干燥所得蟾酥具有比其他干燥方法更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞抑制效果，但未說(shuō)明產(chǎn)生不同抑制作用的具體成分。李曉龍等[11]進(jìn)行蟾皮抗癌活性成分的正交分離純化研究，首次發(fā)現(xiàn)了一種簡(jiǎn)單高效的3位磺酸化沙蟾毒精的合成和富集方法，并通過(guò)該方法對(duì)總蟾毒配基進(jìn)行了磺酸化，實(shí)現(xiàn)了大量具有潛在抗癌活性化合物的合成和富集，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)高效低毒化合物的篩選提供了基礎(chǔ)。韓玲玉等[12]對(duì)華蟾素注射液中化學(xué)成分進(jìn)行研究，結(jié)果顯示蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類為華蟾素注射液的主要抗腫瘤活性成分，其中分離得到的化合物中就有沙蟾毒精。陸國(guó)弟等[13]將沙蟾毒精與牛血清蛋白進(jìn)行分子對(duì)接研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沙蟾毒精能與小牛血清發(fā)生中等強(qiáng)度的結(jié)合，證實(shí)白蛋白是沙蟾毒精的載藥蛋白。Feng等[14]進(jìn)行沙蟾毒精藥代動(dòng)力學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)沙蟾毒精的代謝穩(wěn)定性優(yōu)于其他報(bào)道的蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類化合物，還觀察到CYP3A5基因?qū)ι丑付揪u基化具有偏好性，為闡明沙蟾毒精的Ⅰ期代謝提供了重要數(shù)據(jù)，有助于臨床前藥物的開發(fā)和合理使用。Yuan等[15]通過(guò)基于Mpeg-PLGA的納米膠束系統(tǒng)作為沙蟾毒精的載體進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)納米膠束可能通過(guò)增加藥物分子的細(xì)胞攝取增強(qiáng)了其抗癌作用，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用給藥提供了依據(jù)。

2 沙蟾毒精的抗腫瘤作用

隨著沙蟾毒精化學(xué)成分的進(jìn)一步明確和提取工藝的不斷改進(jìn)，關(guān)于沙蟾毒精抗腫瘤活性的研究也日漸增多，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者紛紛對(duì)其抗腫瘤作用表現(xiàn)出了濃厚的興趣。按照沙蟾毒精抗腫瘤作用機(jī)理不同大致可以分為三類，一是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，二是抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，三是抗腫瘤血管生成。

2.1 沙蟾毒精促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡 關(guān)于沙蟾毒精抗腫瘤作用的研究最早見于2011年，曹惠慧等[16]的研究表明，沙蟾毒精具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性，其可能通過(guò)活性氧自由基(ROS)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子、MAPK和NF-κB信號(hào)通路調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡。隨后有學(xué)者[17, 18]發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精可通過(guò)活化DNA修復(fù)酶PARP和自噬基因LC-3及下調(diào)mTOR表達(dá)，從而抑制HepG2/ADM裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，證實(shí)沙蟾毒精可通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及自噬，從而發(fā)揮抗肝癌作用。黨琳等[19]采用沙蟾毒精處理人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，處理之后處于G2/M期細(xì)胞數(shù)量明顯增加，Bax蛋白表達(dá)升高，bcl-2蛋白表達(dá)降低，推測(cè)沙蟾毒精可能通過(guò)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡。Deng等[20]通過(guò)分子模擬等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精可能通過(guò)ATM/ATR信號(hào)通路發(fā)揮細(xì)胞周期阻滯作用，從而達(dá)到促細(xì)胞凋亡效果。Xu等[21]通過(guò)構(gòu)建結(jié)腸癌EGFP-SW480細(xì)胞裸鼠原位癌模型，觀察到沙蟾毒精可以誘導(dǎo)Bax蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)沙蟾毒精是通過(guò)Bax-PGAM5L-Drp1復(fù)合物介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用。Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞G2/M周期阻滯，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡，還可以增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱和5-氟尿嘧啶的敏感性。劉倩等[23]研究發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精可以促進(jìn)肺癌PC-9細(xì)胞凋亡，并且發(fā)現(xiàn)這一效應(yīng)可能是通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)的。還有研究[24]指出，沙蟾毒精可以引起非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞及NCI-H460細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡的發(fā)生可能與Noxa相關(guān)的信號(hào)通路激活有關(guān)。Li等[25]采用Hoechst33342熒光染色觀察到，沙蟾毒精作用于非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞后，邊集的細(xì)胞不斷增加，細(xì)胞核高度固縮、凝聚，出現(xiàn)凋亡小體；AnnexinV-PI雙染結(jié)果顯示，沙蟾毒精可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，且呈劑量依賴性。Deng等[26]對(duì)沙蟾毒精誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡進(jìn)行研究，結(jié)果表明沙蟾毒精在體內(nèi)外都具有良好的抗乳腺癌活性，能夠抑制乳腺癌移植瘤組織中腫瘤細(xì)胞的增殖活力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其可能發(fā)揮作用的機(jī)制是激活JNK通路、調(diào)控YAP磷酸化，最終導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。Yue等[27]研究發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精可以誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡和G2/M周期阻滯。Lv等[28]通過(guò)對(duì)比沙蟾毒精及蟾毒靈對(duì)人食管鱗狀細(xì)胞癌的抗癌效力，發(fā)現(xiàn)沙蟾毒精的抗癌作用更強(qiáng)，且對(duì)人正常食管鱗狀細(xì)胞的毒性較低，表明沙蟾毒精在癌癥和正常細(xì)胞之間具有很高的選擇性，其發(fā)揮抗癌效力的機(jī)制可能為通過(guò)內(nèi)源和外源途徑激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)，通過(guò)增強(qiáng)caspase磷酸化激活P53信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡，證明了沙蟾毒精對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的P53靶向治療潛力。Han等[29]進(jìn)行沙蟾毒精對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U-87細(xì)胞作用的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)沙蟾毒精對(duì)癌性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有明顯的促凋亡作用，且具有較高的選擇性，其可能通過(guò)p38/MAPK信號(hào)通路發(fā)揮作用，并在大鼠的腦脊液中發(fā)現(xiàn)了沙蟾毒精，為沙蟾毒精在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的應(yīng)用提供了依據(jù)。

2.2 沙蟾毒精抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移 目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)沙蟾毒精的抗腫瘤作用研究多集中在其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡方面，對(duì)抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的研究相對(duì)較少。曹惠慧等[16]研究發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精可以抑制肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Wang等[22]研究也發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精可以下調(diào)磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體水平，從而發(fā)揮抑制胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。Chen等[30]研究發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精通過(guò)下調(diào)β-catenin通路抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制前列腺癌PC3細(xì)胞的侵襲和遷移，為沙蟾毒精作為轉(zhuǎn)移性前列腺癌的治療方法提供了依據(jù)。

2.3 沙蟾毒精抑制腫瘤血管生成 腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴于周圍血管的支持，抗腫瘤血管生成藥物可以切斷腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所需的氧氣及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)間接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。劉俊珊等[31]研究發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精具有明顯的體內(nèi)外抑制血管生成的作用，推測(cè)其抑制作用可能與誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞周期阻滯及凋亡有關(guān)。隨后有研究[18]進(jìn)一步指出，沙蟾毒精可以通過(guò)抑制VEGFR-2信號(hào)通路抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的血管生成。

3 沙蟾毒精臨床應(yīng)用需解決的問(wèn)題

目前沙蟾毒精的抗腫瘤作用研究多集中在促腫瘤細(xì)胞凋亡方面，這可能與其具有殺傷腫瘤細(xì)胞的特性有關(guān)，但關(guān)于沙蟾毒精是否選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的研究卻并不充分，只有少數(shù)研究對(duì)比了沙蟾毒精對(duì)正常組織細(xì)胞的作用，論據(jù)的缺乏限制了沙蟾毒精的進(jìn)一步臨床應(yīng)用。

沙蟾毒精的毒性作用及不良反應(yīng)也是下一步臨床應(yīng)用需要解決的主要問(wèn)題。有研究[32,33]表明，沙蟾毒精可能通過(guò)結(jié)合鈉-鉀泵ATP酶的α亞基對(duì)鈉-鉀泵產(chǎn)生抑制作用。進(jìn)一步研究[34]表明，該機(jī)制可能會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣超載和能量紊亂，臨床表現(xiàn)為超過(guò)一定劑量時(shí)產(chǎn)生心肌抑制導(dǎo)致傳導(dǎo)阻滯和緩慢心律失常。如何控制沙蟾毒精應(yīng)用劑量和減毒也是下一步研究的重點(diǎn)。Hou等[35,36]通過(guò)將抗腫瘤劑與ROS清除劑聯(lián)合使用的策略，合成了6種沙蟾毒精的新型雜交品種，評(píng)價(jià)了它們對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞、阿霉素耐藥亞系HepG2/ADM細(xì)胞和人心肌細(xì)胞系A(chǔ)C16細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性，結(jié)果表明雜交品種對(duì)人心肌細(xì)胞系A(chǔ)C16細(xì)胞的細(xì)胞毒性有所減弱，為降低沙蟾毒精的心臟毒性提供了新的應(yīng)用策略。

綜上所述，沙蟾毒精這一中華大蟾蜍中提取的有效單體成分，其抗腫瘤作用已經(jīng)得到了廣泛關(guān)注，沙蟾毒精可通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤血管生成等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。但是將其應(yīng)用于臨床，還有很長(zhǎng)的路要走，進(jìn)行其抗腫瘤機(jī)制的更深入研究、解決其給藥劑量和降低毒副反應(yīng)是未來(lái)研究的方向。