張臣臣 尹熙惠 楊智昉 何希彪 方成虎

1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院（吉林延邊133000）；2上海健康醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（上海201318）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是冠狀動(dòng)脈閉塞或痙攣所致的血流供應(yīng)出現(xiàn)急劇減少或中斷時(shí)間較長(zhǎng)，使得部分心肌因嚴(yán)重缺血、缺氧發(fā)生局部壞死。MI發(fā)生后，壞死的心肌不可再生，瘢痕組織將取而代之修復(fù)壞死區(qū)域的心肌細(xì)胞。隨時(shí)間推移，MI患者最終會(huì)出現(xiàn)心室重構(gòu)、心力衰竭，嚴(yán)重影響發(fā)病后的生存質(zhì)量，甚至死亡[1]。目前臨床治療MI主要采取3種方法：靜脈溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)。但是上述3種治療方法僅能在短期內(nèi)緩解病情及癥狀，并不能從根本上修復(fù)已經(jīng)受損及死亡的心肌細(xì)胞。因心肌細(xì)胞為高度分化的終末細(xì)胞，壞死后不能再生[2]，上述治療方法對(duì)已壞死心肌無(wú)再生作用。對(duì)于醫(yī)療工作者來(lái)說(shuō)尋求新的治療MI及改善遠(yuǎn)期預(yù)后的方法，意義重大。近年來(lái)，細(xì)胞替代治療以其極具潛力的應(yīng)用前景引起了臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)工作者的關(guān)注[3-6]。其核心策略為利用患者自體或異體細(xì)胞移植入受損組織或器官，最終實(shí)現(xiàn)缺失部位的替代和功能的修復(fù)。

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床研究已證實(shí)移植胚胎干細(xì)胞[7]、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞[8]、臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞[9-11]、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[12-14]、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞[15]等能使壞死的心肌再生，這些干細(xì)胞具有來(lái)源廣泛、容易體外分離、擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，但也存在如社會(huì)倫理問(wèn)題、免疫排斥反應(yīng)、致瘤性、療效不確定性等不足之處[16]。因此，開(kāi)發(fā)一種能解決上述不足的理想細(xì)胞來(lái)源，便成為當(dāng)前細(xì)胞治療研究的熱點(diǎn)[17]。

人羊膜上皮細(xì)胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）克服了以上細(xì)胞的缺點(diǎn)，以其廣泛可用性、干細(xì)胞特性、低免疫源性、分化可塑性、無(wú)致瘤性，容易獲取且不涉及倫理問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn)[18-19]，成為細(xì)胞替代治療MI的一個(gè)新的發(fā)展和研究熱點(diǎn)，近10年來(lái)受到了越來(lái)越多的關(guān)注。本文將圍繞hAECs在MI治療方面的作用及其機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 hAECs的來(lái)源及特性

hAECs單層分布構(gòu)成了羊膜上皮，羊膜上皮與羊水直接接觸，電鏡下可見(jiàn)hAECs表面的微絨毛，使得羊水與羊膜間進(jìn)行物質(zhì)交換。hAECs是在受精后第8天左右由多能性上胚層分化而來(lái)，當(dāng)胚囊嵌入子宮內(nèi)膜間質(zhì)時(shí)分為兩層：原始外胚層和原始內(nèi)胚層。原始外胚層隨后分化為外、中、內(nèi)三個(gè)胚層，并最終形成發(fā)育中的胚胎[16]。羊膜腔在原始外胚層中形成，靠近羊膜腔的細(xì)胞即為hAECs。

有學(xué)者[20-23]提出，器官的發(fā)生始于原腸胚，但是hAECs發(fā)生于原腸胚形成前，以及羊膜腔的隔離，原腸胚的器官形成信號(hào)分子可能不能完全作用于hAECs，推測(cè)其仍然保留有較多的干細(xì)胞特性。hAECs在體外培養(yǎng)的條件下可以表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)記物如OCT-4、NANOG、SOX-2等；胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物如 SSEA-3、SSEA-4、TRA 1-60、TRA1-81；以及間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物CD105、CD90、CD73等[23-28]；除表達(dá)干細(xì)胞特異標(biāo)記外，hAECs還有向三個(gè)胚層組織分化的潛能[29]，國(guó)內(nèi)外大量研究表明可以誘導(dǎo)原代hAECs分化為心肌樣細(xì)胞[30]、成骨樣細(xì)胞[31]、胰島樣細(xì)胞[32]、肝樣細(xì)胞[33]、神經(jīng)樣細(xì)胞[34]等。不僅如此，hAECs可獲得充足的細(xì)胞數(shù)量，無(wú)致瘤性，分泌抗炎因子、防止移植后炎性反應(yīng)的發(fā)生等特點(diǎn)[20]。

2 hAECs在MI治療的作用

體外分化研究中，MIKI等[23]已成功將hAECs分化成三個(gè)胚層的不同細(xì)胞，其中包括中胚層的心肌樣細(xì)胞，證明了hAECs向心肌細(xì)胞分化的細(xì)胞療法的可能性。FANG等[30]將表達(dá)上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記的hAECs移植入由液氮造成的MI大鼠模型后，在1個(gè)月內(nèi)能在體內(nèi)分化成表達(dá)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記MHC的心肌樣細(xì)胞，通過(guò)免疫組化及分子生物學(xué)分析等實(shí)驗(yàn)證實(shí)，分化后的細(xì)胞有效減少了梗死面積，PET及超聲心動(dòng)圖等實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分析進(jìn)一步顯示，心臟功能也得以部分恢復(fù)。該研究更進(jìn)一步將hAECs移植與臍帶血及脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞移植的效果做了對(duì)比，結(jié)果顯示hAECs能夠達(dá)到與臍帶血及脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞相似的MI治療效果。值得注意的是，移植入心臟的hAECs存活率僅有3%，且其治療機(jī)制尚不明確，預(yù)示此移植方案仍有很大的調(diào)整和優(yōu)化空間。盡管如此，在此研究中展現(xiàn)的較好治療效果仍然說(shuō)明，hAECs可能是心肌再生細(xì)胞治療的極佳細(xì)胞來(lái)源。王鈺瑩等[35]將hAECs移植到左前降支結(jié)扎的大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)hAECs移植組較MI模型組梗死區(qū)存活的心肌細(xì)胞更多，纖維化程度更小，左心室重構(gòu)減輕、延緩。

基于以上研究，ROY等[28]認(rèn)為hAECs較低的移植效果可能是由于hAECs本身不具有較高的移動(dòng)性和合適的胞外基質(zhì)導(dǎo)致的，所以用TGF-β1對(duì)hAECs進(jìn)行了上皮間充質(zhì)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），并將 EMT-hAECs移植入前降支結(jié)扎的MI小鼠模型。在體外hAECs培養(yǎng)基中加入TGF-β1培養(yǎng)6 d后，hAECs典型的鵝卵石樣形態(tài)改變，呈成纖維細(xì)胞形狀，且細(xì)胞體積增大，細(xì)胞移動(dòng)性增強(qiáng)。通過(guò)免疫組化及分子生物學(xué)分析等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，與hAECs相比EMT-hAECs膜表面蛋白、分子信號(hào)傳導(dǎo)通路、EMT特異蛋白比例、明膠酶的活性、細(xì)胞基質(zhì)、細(xì)胞骨架及基因的表達(dá)樣式都發(fā)生明顯變化，證明了經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后的hAECs實(shí)現(xiàn)EMT，hAECs失去了原有的上皮細(xì)胞特征及基因表達(dá)模式。隨后的MI移植實(shí)驗(yàn)顯示，EMT-hAECs相較hAECs在移植后4周表現(xiàn)出更好的治療效果，包括更高的左室射血分?jǐn)?shù)，更大的心輸出量與心肌形變率。病理及生化分析結(jié)果顯示，EMT-hAECs處理的MI面積更小，TUNEL陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞更少，以及更多的骨膜蛋白分泌，但在心肌血管密度上與hAECs比較無(wú)差異。以上研究顯示出hAECs在MI治療方面的巨大前景。

3 hAECs在MI治療中提高心功能的機(jī)制

在對(duì)MI大鼠模型的細(xì)胞移植中，僅有3%的hAECs轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞[30]。由此可見(jiàn)為數(shù)不多的心肌樣細(xì)胞可能并不是改善心功能的關(guān)鍵因素。SONG等[36]提出hAECs移植后的旁分泌機(jī)制可能在改善心功能中起到關(guān)鍵作用。伴隨著低氧指示分子HIF1α的明顯增多，hAECs分泌的諸多關(guān)鍵細(xì)胞因子都有明顯增加，其中包括促血管生成相關(guān)因子如血管生成素（Ang）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等，以及炎癥相關(guān)因子如白介素6（IL-6）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）。與體外模型結(jié)果一致，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中hAECs移植區(qū)域附近的組織中編碼以上細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平也有顯著提高，證明了hAECs介導(dǎo)的旁分泌通路的確在移植后發(fā)揮了正向的作用。值得注意的是，與移植1 d后的檢測(cè)結(jié)果相比，一周后部分細(xì)胞因子如EGF和IL-6的表達(dá)有明顯的下降，說(shuō)明hAECs的旁分泌療效持續(xù)時(shí)間較短。這也反映了hAECs用于細(xì)胞替代治療的不足之處。優(yōu)化hAECs的特性成為其繼續(xù)發(fā)展另一途徑。

與未修飾的hAECs移植相比，EMT-hAECs并不是通過(guò)增強(qiáng)血管再生或心肌細(xì)胞再生的途徑來(lái)提高h(yuǎn)AECs改善心功能的作用，而是借由減少梗死區(qū)TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞數(shù)量、促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞分泌骨膜蛋白、激活整合素介導(dǎo)的局灶性粘附激酶信號(hào)以加快成纖維細(xì)胞增殖和遷移，以及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重構(gòu)等分子與細(xì)胞機(jī)制，進(jìn)一步縮小梗死面積。IL-8為EMT-hAECs治療過(guò)程中增加最明顯的細(xì)胞因子，其對(duì)人類(lèi)心力衰竭有不良影響。但另一方面，IL-8已被證實(shí)有調(diào)節(jié)骨髓血管母細(xì)胞心肌歸巢和血管生成作用。IL-8的作用仍存在爭(zhēng)議[37]，但為靶向化治療MI提供了科學(xué)依據(jù)。

旁分泌作為移植細(xì)胞保護(hù)心肌、提高心功能的機(jī)制之一，為hAECs移植治療MI提供了新方向。各種干細(xì)胞衍生的外泌體通過(guò)向細(xì)胞外分泌一些蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體及小RNA，在細(xì)胞及組織之間傳播信息，保護(hù)心臟功能[38]，參與梗死后心臟的修復(fù)[39]。其中KHAN等[40]的研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞來(lái)源的外泌體促進(jìn)MI后新生血管的生成、提高心肌細(xì)胞存活及降低心臟纖維化的發(fā)生。其研究還發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞源的外泌體作用機(jī)制是通過(guò)向心臟祖細(xì)胞傳遞miR-294，促進(jìn)心臟祖細(xì)胞的存活及增殖，從而修復(fù)受損心肌，提高心功能。除此之外還有各種間充質(zhì)干細(xì)胞[41-43]，其衍生的外泌體有同樣的功效。值得注意的是不同干細(xì)胞，其外泌體包含的成分及其作用機(jī)制各不相同。hAECs在移植到梗死心肌后，心功能較移植前提高，是否與其外泌體機(jī)制有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

4 hAECs在MI治療的臨床運(yùn)用及前景

目前用于MI細(xì)胞替代治療的臨床試驗(yàn)方式有如下3種：經(jīng)冠狀動(dòng)脈注射、心肌內(nèi)注射、靜脈注射。經(jīng)冠狀動(dòng)脈注射在臨床試驗(yàn)研究中最常見(jiàn)，即直接將干細(xì)胞注射到冠狀動(dòng)脈。在YANG等[44]的臨床試驗(yàn)中，16例前壁心肌梗死的患者行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)3周后，隨機(jī)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)左前降支或右冠狀動(dòng)脈注入。6個(gè)月后，隨訪發(fā)現(xiàn)患者心功能較移植前有明顯改善。但此移植方式仍存在不足，經(jīng)冠狀動(dòng)脈注射在治療過(guò)程中可能引起短暫的冠狀動(dòng)脈血流減少、遠(yuǎn)端心肌缺血，甚至可能造成微循環(huán)堵塞導(dǎo)致新的心肌梗死。心肌內(nèi)注射的方式，即將細(xì)胞直接注射到病灶處，最大程度的保證靶部位移植細(xì)胞的數(shù)量，但其操作步驟復(fù)雜且存在心臟穿孔、血栓栓塞及惡性心律失常的風(fēng)險(xiǎn)[45]。靜脈注射，即將移植細(xì)胞直接注入到靜脈中，移植細(xì)胞經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)靶器官，此方法雖操作簡(jiǎn)單，但其致命缺點(diǎn)決定了此種方式移植效率最差。移植細(xì)胞注入循環(huán)系統(tǒng)后，大部分會(huì)遷徙到肺臟和肝臟中，真正歸巢到心臟的細(xì)胞數(shù)量?jī)H占很小一部分[46]。目前已有的臨床試驗(yàn)證實(shí)，只有少于10%的干細(xì)胞在移植24 h后能存活。移植4周后，心臟中移植的干細(xì)胞僅有約1%能存活[47]。干細(xì)胞移植前預(yù)處理，提高其在靶器官的存活率顯得尤為重要[48]。目前應(yīng)用到臨床試驗(yàn)的主要的方法有：通過(guò)基因修飾技術(shù)，向移植細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染抗凋亡基因[49]，此方法雖可以提高干細(xì)胞移植后的存活率，但基因修飾后的干細(xì)胞實(shí)際治療效果有待進(jìn)一步臨床試驗(yàn)證實(shí)；將移植細(xì)胞與生物材料結(jié)合后移植[50-51]，即把移植細(xì)胞和先進(jìn)的生物材料及技術(shù)結(jié)合以提高移植細(xì)胞存活率，但此方法實(shí)現(xiàn)條件較繁瑣，運(yùn)用到實(shí)際臨床試驗(yàn)前還需不斷優(yōu)化；移植前予以缺血、缺氧處理，增強(qiáng)其對(duì)缺氧環(huán)境下的耐受性[52-53]，即在移植前，預(yù)先將移植細(xì)胞置于和移植靶區(qū)類(lèi)似的缺氧環(huán)境中，激活抗凋亡及抑制促凋亡通路，提高移植細(xì)胞的存活率。短時(shí)間內(nèi)，此種方法有效，但移植后遠(yuǎn)期存活率，有待深入研究。

FANG等[30]研究中證明了在大鼠MI模型中移植hAECs后，有3%hAECs轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞，且大鼠的心功能得到改善，但是其研究并未闡明心功能改善的具體機(jī)制。SONG等[36]在hAECs治療MI的研究中提出了旁分泌機(jī)制，并解釋了hAECs移植到梗死心肌后通過(guò)分泌各種促血管生成因子，使梗死區(qū)側(cè)支循環(huán)生成，挽救更多受損瀕臨死亡的心肌以改善心功能。此研究雖證明了旁分泌機(jī)制改善心功能的可行性，但未進(jìn)一步研究明確哪些細(xì)胞因子在MI治療中起到關(guān)鍵作用。若能明確hAECs分泌的哪些關(guān)鍵細(xì)胞因子能修復(fù)受損心肌細(xì)胞，體外培養(yǎng)hAECs，提取關(guān)鍵細(xì)胞因子，再應(yīng)用到MI患者身上，也不失為一種治療MI的新途徑。其研究還發(fā)現(xiàn)hAECs移植后持續(xù)分泌細(xì)胞因子的時(shí)間并不長(zhǎng)，間接說(shuō)明了hAECs在MI治療中存在的一些劣勢(shì)。

應(yīng)對(duì)hAECs存在的缺點(diǎn)，ROY等[28]研究中提出在體外使用TGF-β1改良優(yōu)化hAECs，然后再移植到MI小鼠模型中，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明EMT-hAECs可以增強(qiáng)hAECs治療MI的作用。并闡述hAECs優(yōu)化后是通過(guò)減少受損心肌的凋亡及調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)加快修復(fù)受損心肌來(lái)提高對(duì)心功能的保護(hù)作用。體外進(jìn)一步優(yōu)化hAECs特性，再應(yīng)用到具體細(xì)胞治療，是細(xì)胞替代治療又一個(gè)新的發(fā)展方向。外泌體在保護(hù)及修復(fù)心臟的作用得到越來(lái)越多研究證實(shí)，但是其具體機(jī)制尚不明確，尤其hAECs，其外泌體在MI作用中的研究仍是空白，值得進(jìn)一步深入探究。

雖然hAECs細(xì)胞替代治療研究還停留在臨床前實(shí)驗(yàn)研究上，卻為MI治療提供了更多方向和手段，其在MI治療的研究潛力是不可估量的。相信其后續(xù)研究能有更大進(jìn)展，并真正應(yīng)用到臨床實(shí)踐中。