席志超，闕祖俊，馮極靈，田建輝,4＊＊，徐宏喜＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學中藥學院 上海 201203；2.中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心上海 201203；3.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院 上海 200032；4.上海市中醫(yī)藥研究院中醫(yī)腫瘤研究所 上海 200032）

最新數據顯示，肺癌已位居全球惡性腫瘤致死率的首位[1，2]，其中約90%的肺癌患者的死亡是由于腫瘤轉移和復發(fā)[3]。目前包括手術、放療、化療、分子靶向、免疫治療在內的綜合治療已經逐步提高肺癌患者的療效，但對已經發(fā)生轉移和復發(fā)的患者獲益有限，5年生存率僅為15%[3]。因此，復發(fā)轉移是導致肺癌死亡的最主要事件，急需提高干預水平以改善總體預后。

長期以來，由于缺乏有效的理論和技術模型支持腫瘤轉移和復發(fā)的轉化研究，臨床上缺乏有效預防肺癌復發(fā)與轉移的干預手段。田建輝研究組在劉嘉湘教授“扶正治癌”學術思想的指導下，融合現代腫瘤學和免疫學的進展，提出“正虛伏毒”為肺癌發(fā)生發(fā)展的核心病機[4]，其中“正虛”主要是免疫功能紊亂；而“伏毒（邪）”指患者體內存在的多種癌細胞[5]，其中包括靜止期癌細胞（Quiescent cancer cell，QCC）。該理論提示“伏毒”具有正氣旺盛則潛伏而不發(fā)病的特征，因此針對“伏毒”自身或其生存環(huán)境進行調控，有望預防肺癌的復發(fā)轉移。這一學術觀點與現代腫瘤研究中所發(fā)現的潛伏靜止期癌細胞是腫瘤轉移和復發(fā)的主要原因的理論不謀而合。

徐宏喜教授研究團隊近年來一直致力于靜止期癌細胞的研究，率先提出靶向靜止期癌細胞預防腫瘤復發(fā)轉移的治療策略。目前已經建立了靜止期癌細胞體外篩選平臺，及一系列靜止期癌細胞分子機理研究及藥物研發(fā)的實驗方法及動物模型?，F已完成了對近2000個化合物的活性篩選，并發(fā)現了首個中藥來源的具有抑制靜止期癌細胞激活作用的小分子化合物Guttiferone K[6,7]。本文將從靜止期癌細胞調控理論出發(fā)，綜述靜止期癌細胞目前的研究現狀，力圖揭示用中醫(yī)藥維持“帶瘤生存”的可能分子機制，為預防復發(fā)轉移研究提供全新的思路。

1“帶瘤生存”是中醫(yī)藥治療肺癌的臨床優(yōu)勢和特色，癌細胞處于靜止期是重要基礎

中西醫(yī)治療惡性腫瘤的理論和實踐模式逐漸趨同。主要體現在惡性腫瘤的治療理念逐步從“消瘤為主”向“人瘤并重、以人為本”轉變，中醫(yī)學治療惡性腫瘤的理念凸顯出優(yōu)勢，“帶瘤生存”的治療策略得到中西醫(yī)界的廣泛共識[8]。

“帶瘤生存”的治療理念已經提出20余年，其內涵主要是：一方面指晚期癌癥患者與腫瘤“共存”，其實體瘤可從臨床影像學進行評估；另一方面是指惡性腫瘤患者體內存在癌細胞，但是現代的臨床檢查手段還難以檢測發(fā)現。其中第二種情況，正是目前臨床上肺癌根治術后患者的病理狀態(tài)。臨床上沒有顯著癥狀的原因之一，可能是這些患者體內殘留的腫瘤細胞大部分暫時進入了靜止期。深化對靜止期癌細胞的認識，開發(fā)相應的干預策略，是預防肺癌復發(fā)轉移的重要方向之一。

2 靜止期癌細胞及其特征

2.1 靜止期癌細胞的基本特征

靜止期癌細胞已經被證實存在于多種惡性腫瘤中，臨床病理學上表現為核增殖蛋白Ki-67呈陰性，且具有重新增殖的能力。一旦這些靜止期癌細胞被激活并重新啟動細胞周期進程，就會導致腫瘤細胞增殖，促進癌癥的復發(fā)。因此，靜止期癌細胞被認為是引起癌癥復發(fā)的重要原因，抑制靜止期癌細胞的激活對預防腫瘤復發(fā)，延長“帶瘤生存者”的生存期具有重要的意義。

靜止期癌細胞是指暫時退出細胞周期進程，進入G0期的癌細胞，屬于腫瘤休眠機制中的一種，即細胞休眠。靜止期是一種細胞狀態(tài)，多種癌細胞均可進入靜止期，包括：腫瘤細胞、腫瘤干細胞(Cancer stem cell，CSC)、播散腫瘤細胞（Disseminating tumor cell，DTC）和循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cells，CTCs)等。腫瘤組織具有異質性，由多種不同狀態(tài)的癌細胞構成，其本身含有一定比例的處在靜止期狀態(tài)的癌細胞。此外，癌細胞周圍環(huán)境的改變也會誘導癌細胞進入靜止期，比如：營養(yǎng)缺乏、缺氧、放化療刺激、免疫環(huán)境改變等。目前靜止期癌細胞的體外研究模型也主要基于以上原理，如：去血清培養(yǎng)法、接觸抑制生長法、3D 細胞培養(yǎng)法及放化療誘導法等。去血清培養(yǎng)法和接觸抑制生長法具有操作方便、穩(wěn)定好、易于后續(xù)藥物篩選及檢測等優(yōu)點，是運用時間最長、使用最多的靜止期癌細胞誘導方法，也是本研究團隊應用率最高的兩種靜止期模型。

2.2 腫瘤細胞進入靜止期是啟動自我保護功能的一種機制

2.2.1 首先，靜止期癌細胞可以逃避放療和化療藥物的作用而存活

放療和大多數化療藥物產生細胞毒作用都需要依賴于細胞周期，如5-Fu和Gemcitabine可干擾S期細胞的DNA合成、紫杉醇和長春花堿可導致M期的細胞無法完成有絲分裂等，因而能夠殺死快速增殖的癌細胞。靜止期癌細胞處在G0期，所以對放化療均不敏感，不能夠有效的被清除。筆者所在研究團隊建立的多株靜止期癌細胞對多種化療藥物均表現出較強耐受性。此外，田建輝研究組建立的人肺癌循環(huán)腫瘤細胞系（CTC-TJH-01）與原發(fā)肺癌細胞相比，對順鉑和紫杉醇的耐藥性更強[9]。當CTC-TJH-01 細胞采用懸浮培養(yǎng)后，處于靜止期的CTC 比例升高，且對化療藥物不敏感（數據待發(fā)表）。肺癌干細胞是指一群所占比例小、具有自我更新和多向分化潛能的腫瘤細胞，其通常處于靜止期狀態(tài)，具有較高的DNA損傷修復能力和高表達藥物抗性膜轉運蛋白。大量研究表明肺癌干細胞與化療耐受和轉移相關[10]。另外，研究表明，放化療本身也可以誘導部分腫瘤細胞進入靜止期[11]。由此可見，這些存活下來的靜止期癌細胞，不但會造成放化療的失敗，更是為癌癥的復發(fā)埋下了隱患。

2.2.2 靜止期癌細胞可以在營養(yǎng)缺乏及低氧環(huán)境下存活

在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中，實體瘤不斷變大，但新生血管還未形成。此時，隨著腫瘤細胞與血管距離的增大，營養(yǎng)和氧的供應逐漸減少，腫瘤組織的主要構成由快速分裂的細胞逐漸過渡為低速分裂的細胞。當血管與腫瘤細胞距離大于100μm時細胞基本處于靜止期，以減少對氧和營養(yǎng)的需求，從而能夠存活下來[12，13]。研究證明腫瘤細胞會向周圍分泌促進血管新生的物質[14]，當新的腫瘤血管形成并為靜止期癌細胞提供營養(yǎng)和供氧時，靜止期癌細胞就會重新啟動細胞周期并增殖，進而促進癌癥的惡化，復發(fā)及轉移。

2.2.3 靜止期癌細胞還可能促進DTC和CTC的存活，造成腫瘤遠端轉移及復發(fā)

Srinivas Malladi 等研究發(fā)現播散性腫瘤細胞可通過自分泌DKK1 抑制WNT 通路誘導自身進入靜止期和逃避先天免疫殺傷，進而在遠處靶器官以潛伏癌細胞的形式存活[15]。此外，Maria Spiliotaki 等研究發(fā)現早期乳腺癌無癥狀患者外周血中82.4%的CTC處于休眠狀態(tài)，而休眠狀態(tài)的CTC 是維持其在外周血中存活，抵抗放化療，逃避抗腫瘤免疫反應和發(fā)生轉移所必需的[16]。此外，癌細胞進入靜止期還可以獲得某些抑癌基因的突變，導致靜止期癌細胞重新激活后能夠更加快速的增殖[17]。

3 抑制靜止期癌細胞激活研究進展

3.1 靜止期癌細胞激活的分子機理研究

靜止期癌細胞再次激活對腫瘤復發(fā)與轉移的重要意義已經獲得越來越多的關注。目前已經發(fā)現了一些對靜止期癌細胞重新激活起到關鍵調控作用的分子機理。其中細胞周期蛋白（Cyclin）和周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）形成復合物時可以通過激活下游pRb-E2F 通路，啟動細胞周期[18]。此外，調控G0到G1/S 期的cyclin D/E-CDK 2/4/6 復合物在靜止期癌細胞中均低表達，在促有絲分裂信號的刺激下，Cyclins-CDKs復合物被激活并上調，進而磷酸化視網膜細胞瘤蛋白質pRb，高磷酸化水平的pRb 蛋白將會導致真核生物轉錄因子2(E2F)的釋放。E2F 會進一步轉錄下游的靶基因，促進細胞進入S期，啟動細胞周期進程[19，20]。本課題組研究表明，當誘導LNCaP和PC-3細胞進入靜止期后，cyclin D/E和CDK 2/4/6的表達均低于增殖期的表達水平。當靜止期癌細胞重新激活后，這些蛋白的表達水平分別在6-12 h 開始增加，Cyclins-CDKs 復合物被激活，E2F 蛋白的表達在24-48 h 有了明顯的升高，促使靜止期LNCaP 和PC-3的激活。

周期素依賴性蛋白激酶抑制因子（cyclin-dependentkinase inhibitor，CKI）主要包括CIP/KIP 和INK4 家族，CKIs 可以通過與CDKs 結合抑制其活性，從而抑制細胞周期從G0期到G1/S期的轉變。p27作為CKI 的典型代表能廣泛的抑制多種細胞周期蛋白和激酶的活性，p27 不僅能抑制已結合到cyclin 并被激活的CDK 的活性，還可以抑制CDK 的激活過程[21]。研究表明，p27在靜止期癌細胞中的表達水平明顯高于增殖期癌細胞，并在靜止期癌細胞激活過程中表達水平逐漸降低。當在此過程中阻止p27 的下調時，靜止期癌細胞就不能夠順利地進入細胞周期[22]，說明p27 可以作為抑制靜止期癌細胞重新激活的重要靶蛋白。課題組研究發(fā)現，處于靜止期的LNCaP和PC-3細胞中，p27和p21的表達水平明顯高于增殖期的表達水平。當靜止期癌細胞重新激活后，這些蛋白的表達水平分別在6-12 h開始下降，不能夠抑制Cyclins-CDKs 復合物的活性，靜止期LNCaP和PC-3細胞重新啟動細胞周期。

c-Myc 蛋白作為重要的原癌基因，是調控細胞周期進程的重要蛋白。c-Myc的表達水平在靜止期癌細胞中明顯低于增殖期癌細胞，并在細胞重新進入細胞周期的過程中迅速被激活，表達水平快速增加。研究表明，在靜止期癌細胞中過表達c-Myc 蛋白可以誘導靜止期癌細胞的激活，敲除或使c-Myc 蛋白失活則會阻礙靜止期癌細胞的激活[23]。c-Myc 不僅可以通過轉錄上調Cyclins-CDKs 復合物的表達水平，還可以通過激活CAK(CDK activating kinase)和抑制CKI 的活性調控G0到G1/S期的進程[24,25]。課題組前期工作中發(fā)現，c-Myc 蛋白在靜止期前列腺癌細胞中的表達非常低，幾乎檢測不到，但是細胞一旦被激活，c-Myc 在0.5-1 h就會明顯升高，說明其在靜止期癌細胞激活的過程中處于調節(jié)信號的上游，對細胞周期重新啟動起到了關鍵的調控作用。

Ras-MEK-ERK 和PI(3)K-AKT-GSK3β 這兩條信號通路在靜止期癌細胞激活的過程中起到了重要的調控作用。Ras-MEK-ERK 可以通過磷酸化serine-62（S62）位點增加c-Myc 蛋白的穩(wěn)定性[26]。PI(3)K-AKT可以通過抑制GSK3β 的活性，抑制c-Myc 蛋白在threonine-58（T58）位點的磷酸化，從而穩(wěn)定c-Myc 蛋白，促進靜止期癌細胞的激活[27]。此外，PI(3)K-AKT還可以通過抑制FOXO 轉錄因子的核轉位來抑制p21和p27 的激活，促進G0期細胞進入G1/S 期[28]。研究發(fā)現p38MAPK 和ERK 通路信號的比值可以作為靜止期癌細胞的鑒定標準，MAPKhigh·ERKlow-1代表細胞進入了G0期[29]。我們研究發(fā)現在靜止期的LNCaP 和PC-3 細胞中，c-Myc（T58）和c-Myc（S62）蛋白的變化均與c-Myc蛋白一致。但ERK 蛋白的活性在兩個細胞株上并不一致，靜止期PC-3 細胞的活性反而高于增殖期，LNCaP 中則相反，這種差異的意義及分子機制還需要進一步研究。

整合素(integrin)屬于異質二聚體跨膜蛋白家族，通過調控酪氨酸激酶完成細胞外基質與細胞內信號的雙向傳導，可以促進細胞的運動、增殖和存活。其中β 1-整合素(β1-integrin)及其下游的酪氨酸激酶黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)對靜止期癌細胞的激活起到了重要的調控作用。在靜止期癌細胞中上調β 1-integrin 蛋白可以啟動細胞周期，當β1-integrin 蛋白活性被抑制則會抑制細胞增殖，促使細胞進入靜止期[30]。β1-integrin/FAK信號通路調節(jié)靜止期癌細胞激活的下游通路包括：AKT、MAPK及肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)等[31,32]。鑒于β1-integrin/FAK 信號通路對于靜止期癌細胞激活的重要作用，我們也正在開展相關的作用機理及藥物篩選研究。

3.2 抑制靜止期癌細胞激活的藥物研究

靜止期癌細胞的激活是導致腫瘤轉移復發(fā)的重要原因，若可以保持癌細胞處在G0期或者阻滯G0期的癌細胞重新進入細胞周期，則可以預防癌癥的復發(fā)，若使DTC和CTC保持在G0期，還可以抑制腫瘤的遠端轉移及復發(fā)。CDK4/6 激酶抑制劑帕博西尼(Palbociclib)可以有效的維持多種癌細胞保持在G0/1期，阻止細胞周期啟動[33,34]?；熆梢詫е氯毖醯哪[瘤組織重新獲氧，從而誘導靜止期癌細胞再次增殖，TH-302可以有效的抑制Doxorubicin 治療后重新獲氧的靜止期癌細胞的再次激活[11]。Axelrod 等研究發(fā)現GAS6/AXL 軸介導DTC 在骨髓中休眠[35]，提示調控GAS6/AXL 軸可抑制DTC 在遠處臟器激活，進而抑制轉移發(fā)生。此外，Norazalina Saad 等研究發(fā)現AOE可通過重編程誘導癌細胞進入靜止狀態(tài)[36]?？傮w來說，目前已經報道的靶向靜止期癌細胞激活的藥物研究還比較少。

徐宏喜課題組在已建立的靜止期前列腺癌體外篩選平臺上對近2000 個上市藥物及中藥小分子進行了篩選，發(fā)現了若干個對靜止期癌細胞具有抑制作用的成分。其中，從云南藤黃Garcinia yunnanensis 中提取分離得到的PPAP 類化合物Guttiferone K(GUTK)具有抑制靜止期前列腺癌細胞激活的作用，并對其體內外作用機制進行了深入的研究[6,7]。筆者通過去除血清培養(yǎng)(LNCaP)和接觸抑制生長(PC-3)的方法誘導前列腺癌細胞進入靜止期，通過重新加入血清或降低細胞生長密度的方法誘導靜止期細胞重新進入細胞周期，同時給予不同劑量的GUTK，觀察其對靜止期細胞重新進入細胞周期這一過程中的干預作用。SYBRGreen Assay 和Clonogenic Assay 證明GUTK 呈劑量依賴性的抑制了DNA 的再次合成并降低了靜止期癌細胞形成克隆的能力。進一步采用PI Flow 及Hoechst 和Pyronin Y 雙染的方法檢測細胞周期分布的變化，結果表明GUTK 可以推遲靜止期LNCaP 和PC-3 細胞重新進入細胞周期。GUTK 分別在LNCaP 和PC-3 細胞重新進入細胞周期6 h 和1 h 時就可以明顯下調c-MYC的蛋白水平而不影響其mRNA 水平，進一步的實驗表明GUTK是通過加速c-MYC在泛素-蛋白酶體途徑的降解速度來下調其蛋白水平的。通過轉染c-MYC 的質粒在靜止期前列腺癌細胞中高表達c-MYC 可以削弱GUTK 抑制靜止期細胞重新激活的能力。FBXW7蛋白是能夠特異性識別c-MYC 的E3 ligase，我們發(fā)現GUTK 可以通過增加其穩(wěn)定性來上調FBXW7 的蛋白水平。利用si-RNA 在靜止期前列腺癌細胞中敲除FBXW7 可以削弱GUTK 抑制靜止期癌細胞重新激活的能力，證明FBXW7-c-MYC 通路是GUTK 作用的主要通路。裸鼠皮下成瘤的實驗證明，GUTK 對靜止期癌細胞的治療作用具有長效性。此外，筆者還將靜止期的PC-3 細胞皮下接種于裸鼠的背部并預防性給予GUTK，治療組的腫瘤體積及重量明顯比對照組減少，且裸鼠體重并無明顯差別，可見腹腔注射GUTK 可以抑制靜止期前列腺癌的生長，并且無明顯毒副作用。以上研究發(fā)現，云南藤黃中的活性成分GUTK 能夠通過穩(wěn)定FBXW7 蛋白來加速c-MYC 蛋白的降解，從而抑制靜止期前列腺癌細胞的激活，具有潛在的預防前列腺癌復發(fā)的作用。目前我們正在對篩選得到的具有抑制靜止期癌細胞激活作用的上市藥物進行活性及機理研究，該工作有望發(fā)現藥物的新機理和適應癥，賦予老藥新的用途。

此外，田建輝課題組研究發(fā)現臨床上具有延長肺癌患者生存期、穩(wěn)定腫瘤病灶作用的金復康口服液可誘導肺癌循環(huán)腫瘤細胞進入靜止期[37,38]。

4 總結與展望

4.1 引入靜止期癌細胞理論創(chuàng)新中醫(yī)藥防治肺癌的思路

2006年世界衛(wèi)生組織（WHO）把原來作為“不治之癥”的“癌癥”重新定義為可以治療、控制甚至治愈的“慢性病”，這意味著癌癥的治療應該更加關注于如何預防癌癥的復發(fā)和延長患者的生存期。這一理念與中醫(yī)藥在癌癥防治中所倡導的維持“帶瘤生存”的理論高度契合。目前“帶瘤生存”的患者不斷增多，僅在美國就有1200 萬。然而這部分“帶瘤生存”的人群卻時刻面臨著癌癥復發(fā)的風險，且復發(fā)瘤一旦形成將比原發(fā)瘤生長更快，并對再次放化療的敏感度降低甚至抵抗，成為癌癥患者死亡的主要原因。傳統(tǒng)癌癥治療的思路大都旨在手術清除癌細胞、誘導癌細胞死亡和抑制其生長，但事實證明目前仍然無法徹底清除患者體內的癌細胞。放化療后殘留的靜止期癌細胞一旦重新進入活動期，就會導致腫瘤的復發(fā)，目前關于靜止期癌細胞存活及激活的分子機理研究還不深入，幾乎沒有靶向抑制靜止期癌細胞激活的藥物。中醫(yī)藥具有多成分、多靶點和整體治療的特點，可能對癌細胞自身和腫瘤生存的環(huán)境進行干預，從而調控癌細胞處于靜止期，甚至清除這些癌細胞，最終達到預防復發(fā)轉移的目的。

4.2 靜止期癌細胞研究方向展望

總體來講，該領域處于探索階段，其生物學和分子機理特征尚待進一步明確，研究技術上也有諸多的難點，例如缺乏可視化的檢測手段、精準化的靜止期癌細胞模型、適宜的動物模型等。我們認為如果從以下方面開展研究，可以幫助突破上述瓶頸。

首先應該對靜止期癌細胞的生物學特征進行系統(tǒng)的研究，如采用聯合組學的方法比較靜止期癌細胞與增殖期癌細胞在基因組、轉錄組、蛋白組和代謝組學上的差別，通過生物信息學分析，發(fā)現靜止期癌細胞存活及激活的潛在調控基因及信號通路。其次，對這些候選基因的調控作用進行體內外的驗證，鑒定出對靜止期癌細胞激活起到“開關”作用的關鍵基因。通過調控這些“開關”基因控制癌細胞進出靜止期，則可以得到精準的體內外靜止期癌細胞模型，在此基礎上采用熒光標記等技術即可進行體內外的可視化檢測及靶向性的藥物開發(fā)。筆者所在的研究團隊，已經完成了聯合組學的工作，并從候選的基因中鑒定了出了對靜止期癌細胞激活具有類似“開關”作用的調控基因，目前正在對其作用機理進行深入的研究。此外，基于該靶基因的藥物篩選及開發(fā)也在進行中。我們期望，未來的工作可以發(fā)現更加可靠和公認的靜止期癌細胞的分子標志蛋白，發(fā)現調控靜止期癌細胞存活及激活的關鍵“開關”基因，并基于此開發(fā)靶向靜止期癌細胞的藥物，最終幫助腫瘤患者減少復發(fā)。

4.3 靜止期癌細胞理論促進中醫(yī)藥轉化研究

目前我國癌癥患者在接受手術治療和放化療后，會積極尋求中醫(yī)藥的綜合治療，已經有明確證據表明中醫(yī)藥可預防癌癥的惡化、復發(fā)和轉移，最終延長患者生存期。研究表明，靈芝的有效成分可以抑制靜止期乳腺癌細胞的增殖及存活。結合中醫(yī)藥治療腫瘤的臨床療效及藥理研究，證實中藥中必然存在可以抑制靜止期癌細胞激活的藥物成分。應借助已有的靜止期癌細胞研究平臺及技術，對臨床療效確切的方藥進行活性篩選，發(fā)現有效成分并闡述其作用機理。為臨床用藥提供理論支持，這將對預防肺癌復發(fā)、延長患者的生存期起到非常重要的意義，具有廣闊的應用前景。