郭春莉，付 強(qiáng)，高 穎

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院 北京 100091；2.中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院 北京 100191；

3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院 北京 100700）

中風(fēng)病是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，已成為我國(guó)農(nóng)村和城市人口第一位致殘和死亡的原因[1]。臨床證據(jù)表明，中藥對(duì)缺血性卒中治療有效，其主要是通過(guò)干預(yù)證候達(dá)到改善或治療疾病，臨床研究提示，中風(fēng)急性期約有40%-50%的病人表現(xiàn)出痰熱證，中醫(yī)藥對(duì)中風(fēng)病急性期痰熱證的治療也突顯優(yōu)勢(shì)，MMP-2在血清中的含量可以反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞的壞死程度，也可以反映神經(jīng)細(xì)胞周?chē)臐舛?，也?duì)判斷治療效果有一定幫助。MMP-2與中風(fēng)病急性期痰熱證是否存在相關(guān)性，其相關(guān)性研究能否形成微觀辨證的依據(jù)，以及能否成為證候診斷及療效評(píng)價(jià)的依據(jù)對(duì)中醫(yī)藥治療中風(fēng)病具有重要的意義。

1 研究資料和方法

1.1 臨床資料

本研究數(shù)據(jù)來(lái)源于2013 年8 月-2015 年5 月發(fā)病7天內(nèi)就診于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院的缺血性中風(fēng)痰熱證患者45 名，非痰熱證44 名，發(fā)病年齡均為35歲-85歲。

1.2 篩選中風(fēng)病急性期受試者

1.2.1 疾病診斷

疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2005年衛(wèi)生部疾病控制司、中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)頒布的《中國(guó)腦血管病防治指南（試行版）》的腦梗塞診斷部分。

1.2.2 證候診斷

證候診斷標(biāo)準(zhǔn)參照973 計(jì)劃“缺血性中風(fēng)病證結(jié)合的診斷標(biāo)準(zhǔn)與療效評(píng)價(jià)體系研究”課題組制定的《缺血性中風(fēng)證候要素診斷量表》。

1.2.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)；起病7天以內(nèi)；年齡≥35歲且≤85歲者。

1.2.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

蛛網(wǎng)膜下腔出血者；年齡小于35 歲或大于85 歲者；病程超過(guò)1 周的急性腦血管病患者；既往有腫瘤、造血系統(tǒng)疾病者；有精神性疾病患者；不配合者；資料不全影響結(jié)果判定者。

1.3 臨床信息采集

所有入選受試者均填寫(xiě)統(tǒng)一表格，表格內(nèi)容主要是人口學(xué)資料（指調(diào)查患者的個(gè)人信息，包括患者姓名、性別、出生日期、家庭住址、聯(lián)系電話等）、病史調(diào)查（既往史、家族史、過(guò)敏史、生命體征、一般內(nèi)科情況、神經(jīng)系統(tǒng)檢查等），中風(fēng)病急性期受試者并填寫(xiě)病例觀察表、中風(fēng)病證候要素診斷量表，分為痰熱組和非痰熱組，均于入院后第1日清晨空腹取血，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清MMP-2水平。

1.4 研究方法

1.4.1 證候量化評(píng)定

經(jīng)過(guò)統(tǒng)一組織的量表使用培訓(xùn)后，由納入之日由腦病科醫(yī)師使用《缺血性中風(fēng)證候要素診斷量表》，對(duì)每例患者分別作出內(nèi)風(fēng)證、內(nèi)火證、痰濕證、血瘀證、氣虛證和陰虛證的量化診斷（得分≥10分診斷成立）。

1.4.2 受試者血清MMP-2的測(cè)定

在缺血性中風(fēng)病起病第7 d采肘靜脈血10 mL，留取標(biāo)本后盡快注入EDTA 抗凝管內(nèi)，4℃、3 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，-20℃至-80℃保存待測(cè)。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA 法），檢測(cè)血清中MMP-2的含量（ng·mL-1）。具體操作步驟如下：

1）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：標(biāo)準(zhǔn)品按照說(shuō)明書(shū)稀釋好五個(gè)梯度，各個(gè)梯度每孔加樣量都為50 μL，

2）加樣：分別設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測(cè)樣品10 μL。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。

4）配液洗滌：將30（48T 的20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用；小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

5）加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。6）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。7）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

8）顯色：每孔先加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。

9）終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。

10）測(cè)定：以空白空調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min 以內(nèi)進(jìn)行。（主波長(zhǎng)450，輔助波長(zhǎng)630）

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0版本，組內(nèi)數(shù)據(jù)分析采取獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間分析采取單向方差分析的方法。

2 研究結(jié)果

研究結(jié)果顯示，痰熱組MMP-2的表達(dá)較非痰熱組MMP-2表達(dá)增強(qiáng)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

中藥對(duì)缺血性卒中治療有效，主要是通過(guò)干預(yù)證候達(dá)到改善或治療疾病，因此證候的規(guī)范化研究一直是中風(fēng)病診療研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

“辨證論治”被認(rèn)為是中醫(yī)學(xué)術(shù)思想的精髓，已經(jīng)成為指導(dǎo)中醫(yī)臨床診斷和治療的基礎(chǔ)。1955年，任應(yīng)秋先生發(fā)表了《中醫(yī)的辨證論治的體系》的一文，首次明確提出“辨證論治”這個(gè)概念，“辨證論治是中醫(yī)臨床上不可缺少的基本知識(shí)，所以張仲景的傷寒論和金匱要略兩書(shū)數(shù)十篇，無(wú)一篇不貫以病脈證并治或病脈證治的題目，但中醫(yī)的證候決不同于西醫(yī)的癥狀，中醫(yī)的證候完全是施治用藥的標(biāo)準(zhǔn)，而西醫(yī)的癥狀，不過(guò)是描寫(xiě)病人的異常狀態(tài)，殊非診斷治療上的關(guān)鍵；中醫(yī)的辨證論治，注意于生體病變的全身證候，務(wù)使生體的生活機(jī)能恢復(fù)其正常狀態(tài)，也就是說(shuō)要把病證整個(gè)病理機(jī)轉(zhuǎn)一變而為生理機(jī)轉(zhuǎn)?！盵“2]辨證”就是對(duì)病人四診所收集的臨床信息進(jìn)行概括、判斷為某種證候，是論治的前提和依據(jù)，“論治”是根據(jù)辨的證候來(lái)確定治法和處方譴藥，因此“證候”是連接中醫(yī)學(xué)理論和臨床研究的核心與關(guān)鍵問(wèn)題。傳統(tǒng)中醫(yī)只能依靠望、聞、問(wèn)、切來(lái)獲取患者的臨床信息等病情資料，臨床信息分辨率低、信息量小，模糊性大，信息收集過(guò)程中主觀性很大，而且受到個(gè)人師承、臨床經(jīng)驗(yàn)、認(rèn)知水平和方法及不同時(shí)代的不同，導(dǎo)致辨出的證候差別很大，使得辨證的精確性和重復(fù)性較差，影響了研究結(jié)論的真實(shí)性和可靠性，而且證候的概念模糊不清，表現(xiàn)出對(duì)證候名稱及其內(nèi)涵描述的經(jīng)驗(yàn)化和隨意性。證候與病名、癥狀等術(shù)語(yǔ)的劃分不嚴(yán)格，稱謂的繁雜，內(nèi)容交錯(cuò)，隨意性較大，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。中醫(yī)證候描述的不確定性和缺乏規(guī)范性，這使中醫(yī)學(xué)在現(xiàn)代社會(huì)中的應(yīng)用與發(fā)展受到了很大的制約，不利于中西醫(yī)理論與臨床的相互溝通與交叉滲透，不利于自身的學(xué)術(shù)交流與對(duì)外交流。另外，在療效評(píng)價(jià)方面，證候的療效評(píng)價(jià)也起到了至關(guān)重要的作用，一些專(zhuān)家認(rèn)為不對(duì)證候療效評(píng)價(jià)，就是失去了中醫(yī)的特色和優(yōu)勢(shì)，將會(huì)使中醫(yī)辨證論治個(gè)體化治療的優(yōu)勢(shì)得到削弱。如劉鳳斌等認(rèn)為“證”是中醫(yī)診斷與療效評(píng)價(jià)的核心所在，撇開(kāi)“證”的改善，完全用西醫(yī)的指標(biāo)體系評(píng)價(jià)中醫(yī)的療效，無(wú)異于本末倒置，不利于中醫(yī)藥的發(fā)展[3]。因此，辨證論治的核心地位的確立，對(duì)證候規(guī)范化提出了新的需求。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶類(lèi)之一，其編碼基因具有同源性，依據(jù)基質(zhì)金屬蛋白酶受體(MMPR)的組織特異性不同可分為：MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9 等等。MMP-2 作為MMPs 經(jīng)典成員，可由機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞分泌，活化后可以有效地降解Ⅳ型膠原和纖維粘連蛋白，也對(duì)細(xì)胞和組織的修復(fù)及傷口的愈合有重要影響[4]。MMP-2還具有調(diào)節(jié)凝血因子和補(bǔ)體的作用，當(dāng)其表達(dá)升高同時(shí)，可以引起機(jī)體的纖維蛋白溶解系統(tǒng)的機(jī)制失調(diào)，使腦血管病的發(fā)生率升高。因此，MMP-2在血清中的含量可以反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞的壞死程度，也可以反映神經(jīng)細(xì)胞周?chē)臐舛?，也?duì)判斷治療效果有一定幫助。

臨床研究提示，中風(fēng)急性期約有40%-50%的病人表現(xiàn)出痰熱證，痰為氣血津液代謝紊亂的產(chǎn)物，為有形之邪，具有黏稠重濁之性，易與火熱相結(jié)，二者交結(jié)難解，不易變化。便秘便干、舌苔黃膩、脈弦滑構(gòu)成中風(fēng)病急性期痰熱證的基本證候特征及辨證要點(diǎn)[5]。王永炎院士指出中風(fēng)病急性期病機(jī)錯(cuò)綜復(fù)雜，證候變化多端，病勢(shì)發(fā)展迅猛，難以駕馭，且變證壞證頻見(jiàn)，極易產(chǎn)生神昏、竅閉、厥脫等，為難治重證，提出了“毒損腦絡(luò)”中風(fēng)病機(jī)理論的觀點(diǎn)。中醫(yī)藥對(duì)中風(fēng)病急性期痰熱證的治療也突顯優(yōu)勢(shì)。

大量臨床實(shí)踐證明痰熱證是中風(fēng)病急性期的常見(jiàn)證候，痰熱證的證候演變特點(diǎn)及其與神經(jīng)功能缺損程度密切相關(guān)，中醫(yī)藥主要是通過(guò)干預(yù)中風(fēng)病痰熱證證候因素以改善癥狀或治療疾病。本研究結(jié)合前期研究的基礎(chǔ)上，以王永炎院士提出的“證候概念及其屬性”理論為依據(jù)，以痰熱證與基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)亞型的關(guān)系為切入點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)中風(fēng)病急性期痰熱證的MMP-2的表達(dá)明顯增高，其相關(guān)性研究可以形成微觀辨證的依據(jù)，其成為證候診斷及療效評(píng)價(jià)的依據(jù)對(duì)中醫(yī)藥治療中風(fēng)病具有重要的意義。但該研究受樣本量小的局限，試驗(yàn)結(jié)論可能存在一定的誤差，今后可以擴(kuò)大樣本量、并增加對(duì)MMPs諸多亞型的進(jìn)一步研究，為循證醫(yī)學(xué)研究提供更加客觀的數(shù)據(jù)支持。

通過(guò)總結(jié)分析MMP-2 與中風(fēng)病證候之間的相關(guān)性分析，為證候的規(guī)范化研究奠定了基礎(chǔ)。這些研究成果對(duì)實(shí)施中醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)化戰(zhàn)略，加快構(gòu)建中醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)體系，提高中醫(yī)藥科技競(jìng)爭(zhēng)力，促進(jìn)中醫(yī)藥資源發(fā)揮更大社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義，具有良好的推廣應(yīng)用前景，在做好研究工作的同時(shí)，推廣研究產(chǎn)出的各項(xiàng)方法和技術(shù)，使得研究成果與中醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)踐緊密結(jié)合起來(lái)，充分發(fā)揮科研對(duì)實(shí)踐工作的指導(dǎo)作用，真正實(shí)現(xiàn)科研與實(shí)際工作的相互促進(jìn)。