戴 惟，韓秋漪，李福生，張善端

(復(fù)旦大學(xué)電光源研究所，上海 200433)

1 皮膚光療簡介

光療法是用于治療各類疾病的最古老的療法之一，在古埃及、古印度和中國，陽光在治療皮膚病方面的應(yīng)用已有數(shù)千年歷史。20世紀(jì)60年代末，匈牙利醫(yī)生恩德·梅斯特(Endre Mester)使用低功率紅寶石激光(694 nm)照射小鼠來研究激光的致癌性。令他感到意外的是，激光并未導(dǎo)致癌癥的產(chǎn)生，但改善了小鼠受照面被剃去的小鼠毛發(fā)的生長。這是近代首次低水平光療法(low level light therapy，LLLT)的案例，為皮膚光學(xué)開啟了一條新的研究路徑。發(fā)展至今，用于皮膚光療的光源主要包括相干光(如激光)和非相干光(如LED)兩類，并在全世界范圍內(nèi)得到普及。目前，國內(nèi)外對于激光皮膚光療的研究體系較為成熟，臨床應(yīng)用更為廣泛。

1.1 皮膚光療的作用機(jī)制

人體皮膚由表皮層、真皮層和皮下組織構(gòu)成。表皮層含有角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞和麥克爾細(xì)胞。角質(zhì)形成細(xì)胞占表皮細(xì)胞的80%以上，參與表皮分化、角化等作用；黑素細(xì)胞占表皮細(xì)胞的10%左右，起到遮擋和反射紫外線的作用；朗格漢斯細(xì)胞占表皮細(xì)胞的3%～5%，為免疫活性細(xì)胞；麥克爾細(xì)胞則具有非神經(jīng)末梢介導(dǎo)的感覺作用。真皮層主要由纖維和基質(zhì)構(gòu)成，常駐細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞和肥大細(xì)胞。成纖維細(xì)胞在傷口愈合和皮膚再生中起到重要作用。其他細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、真皮樹狀細(xì)胞等也或多或少地存在于真皮層[1]。

細(xì)胞光生物效應(yīng)的機(jī)制涉及分子、細(xì)胞和組織水平的作用，其機(jī)制尚未完全明確。當(dāng)前研究普遍認(rèn)為，光主要作用于皮膚細(xì)胞中的發(fā)色團(tuán)，發(fā)色團(tuán)吸收光子能量并轉(zhuǎn)化為熱能和化學(xué)能，激活線粒體呼吸鏈組分，從而導(dǎo)致一系列細(xì)胞反應(yīng)。發(fā)色團(tuán)是指賦予化合物顏色的分子(或分子的一部分)，通常以共軛π電子體系和金屬絡(luò)合物形式存在。人體中的發(fā)色團(tuán)主要包括血紅蛋白、肌紅蛋白、細(xì)胞色素、黃素、黃素蛋白和卟啉等。皮膚組織中常見的目標(biāo)發(fā)色團(tuán)是含有鐵和銅的細(xì)胞色素C氧化酶(CCO)，位于線粒體呼吸鏈中[2-4]。德國生物化學(xué)家奧托沃伯格發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素氧化酶負(fù)責(zé)細(xì)胞呼吸的關(guān)鍵步驟，并控制了該過程最終的化學(xué)反應(yīng)。

除一氧化碳(CO)外，一氧化氮(NO)也通常會取代氧與細(xì)胞色素氧化酶結(jié)合，進(jìn)而阻礙細(xì)胞呼吸[5]。當(dāng)細(xì)胞呼吸被阻斷時，會產(chǎn)生自由基或活性氧(ROS)形式的化學(xué)信號，過量時會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]。研究表明，光照會促進(jìn)NO從細(xì)胞色素C氧化酶(CCO)中解離，使得氧再次與其結(jié)合并增強(qiáng)呼吸鏈活性[7]、增強(qiáng)酶活性[8]、影響電子傳遞[9]并促進(jìn)線粒體呼吸和三磷酸腺苷(ATP)的生成[10-13]。此外，通過對活性氧物質(zhì)(如單態(tài)氧物質(zhì))的調(diào)節(jié)，光照將進(jìn)一步改變細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)途徑的激活，改變與細(xì)胞增殖、存活、組織修復(fù)和再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子水平。

相對于高功率激光而言，雖然LLLT在近年來應(yīng)用快速普及，但在某些方面仍存在不確定性。一是入射在細(xì)胞上的光子信號轉(zhuǎn)換成被照組織中生物效應(yīng)的分子機(jī)制尚未完全明確；二是在臨床應(yīng)用中，光照劑量和參數(shù)的選擇存在著大量的不確定性，包括波長、輻照度或功率密度、脈沖結(jié)構(gòu)、相干性、極化、照射時間、接觸與非接觸應(yīng)用等。已有研究表明，細(xì)胞對于光劑量的反應(yīng)有雙相效應(yīng)，即過小的輻照度或時間對于細(xì)胞沒有影響，過大的輻照度或時間可能具有抑制作用。因此可能存在輻照度和時間的最佳平衡值，且不同的波長、組織類型、氧化還原狀態(tài)下的絕對數(shù)值會有所不同，并受到不同脈沖參數(shù)的影響[14]。

1.2 黑素合成的機(jī)制

黑色素是由酪氨酸或3,4-二羥基苯丙氨酸的一系列化學(xué)反應(yīng)形成的一類生物色素。人體皮膚顏色主要受色素沉著過程的影響，包括黑素的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等環(huán)節(jié)，具體包括：在黑素小體中進(jìn)行的黑素細(xì)胞的合成與黑素儲存，黑素小體從細(xì)胞核周邊向樹突末端的轉(zhuǎn)移以及向鄰近角質(zhì)形成細(xì)胞的傳遞，角質(zhì)形成細(xì)胞的再分布和降解等[15]。

黑素生成是一種多步酶促生化反應(yīng)，通過酪氨酸的一系列化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。酪氨酸經(jīng)由酪氨酸酶(TYR)催化后轉(zhuǎn)變成多巴(DOPA)，多巴被氧化脫氫后生成多巴醌。在半胱氨酸的參與下，一部分多巴醌合成褐黑素；另一部分多巴醌形成多巴色素，最終重排為5，6-二羥基吲哚，吲哚與結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合成黑素蛋白即常說的黑素。該一系列過程中TYR和TRP-1是所涉及的關(guān)鍵酶。酪氨酸酶(TYR)是黑色素合成中的關(guān)鍵酶，能夠催化黑色素合成的早期限速步驟，即底物(能和酶特異性結(jié)合的物質(zhì))酪氨酸羥化和DOPA氧化過程。黑色素合成的速率與酪氨酸酶的量和活性直接相關(guān)。酪氨酸酶相關(guān)蛋白1 (TRP-1)也具有與TYR相似的催化活性，主要作用是將酪氨酸運(yùn)送給黑素小體，因此黑色素合成速率也與TRP-1的合成正相關(guān)[16，17]。

黑素細(xì)胞前體起源于神經(jīng)嵴，并遷移分化到各個部位，包括表皮、毛囊、內(nèi)耳、脈絡(luò)膜、軟腦膜等。小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)參與這種遷移過程，是分化過程最早的標(biāo)記物之一，可以通過調(diào)控TYR基因家族來影響黑素合成過程。研究表明，將MITF cDNA轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞中促進(jìn)了成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為樹突細(xì)胞的過程以及黑素細(xì)胞特異性標(biāo)志物(如酪氨酸酶TYR和酪氨酸相關(guān)蛋白TRP-1)的表達(dá)。TYR和TRP-1的編碼基因，即第一個發(fā)現(xiàn)的MITF靶基因，由MITF直接調(diào)節(jié)[18]。

1.3 光照模式

光照模式可分為脈沖光和連續(xù)光。這兩類模式對于細(xì)胞的具體影響機(jī)制目前仍無定論，但脈沖光通常被作為皮膚光療中一類常見的手段用于臨床治療[19，20]。

Sterenborg等[20]使用各類血卟啉文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行理論計(jì)算，認(rèn)為當(dāng)峰值輻照度低于4×108W/cm2時，脈沖寬度為10 ns、100 ns、1 μs、10 μs、100 μs，脈沖模式與連續(xù)模式光動力療法的效率相同。Farouk等[21]在14只大鼠背部制造橢圓形創(chuàng)面，分別使用100～500 Hz不同頻率脈沖和連續(xù)光(635 nm，1.0 J/cm2，0.89 mW/cm2，3次/周)照射進(jìn)行傷口愈合情況對比，結(jié)果顯示100 Hz相對于其他頻率脈沖光有更好的愈合效果，但與連續(xù)光相比并無改善。文章認(rèn)為連續(xù)光在該實(shí)驗(yàn)中有更好的治療效果，原因在于連續(xù)光帶來的光子刺激增加。Brian等[22]通過組織模擬劑量計(jì)研究脈沖/連續(xù)模式下光動力劑的吸收情況，使用690 nm、300 mW/cm2的連續(xù)光和脈沖光(10 Hz，10 nm脈寬)照射劑量計(jì)，結(jié)果顯示脈沖光在劑量計(jì)中的穿透性比連續(xù)光更強(qiáng)。文章認(rèn)為高峰值輻射照射會引起激發(fā)態(tài)飽和，降低劑量計(jì)吸收系數(shù)，使得脈沖光穿透深度更深。Brodon等[23]將人體HEP-2細(xì)胞在完全DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以670 nm、5 J/cm2的連續(xù)光和不同頻率脈沖光(6 Hz、18 Hz、36 Hz、100 Hz、600 Hz)照射72 h，并與無光照組對比，評估細(xì)胞增殖和氧化爆發(fā)情況。結(jié)果顯示細(xì)胞增殖在100 Hz脈沖條件下得到最大刺激，而氧化爆發(fā)在600 Hz時得到最大刺激，從而推斷脈沖模式能夠減少黑色素對光子的吸收，使得更多光子到達(dá)靶細(xì)胞產(chǎn)生治療效果。文章認(rèn)為其原因可能在于特定頻率脈沖光能夠穿過黑色素之間的“空穴”而更好地到達(dá)靶細(xì)胞。Barolet等[19]對10名患者前臂進(jìn)行高低輻照度下連續(xù)和脈沖光照(660 nm，高輻照度：60 mW/cm2，低輻照度：5 mW/cm2)，治療完成72 h后在每個測試區(qū)域中收集皰液并使用放射免疫測定法測定膠原蛋白合成速率。結(jié)果顯示：高輻照度下，脈沖模式III型前膠原生產(chǎn)速率增加50%，連續(xù)模式增加29%；低輻照度下，脈沖模式III型前膠原生產(chǎn)速率增加76%，連續(xù)模式增加38%。文章認(rèn)為其原因可能在于脈沖模式能提供細(xì)胞周期性松弛時間，避免成纖維細(xì)胞衰竭，維持細(xì)胞活性。此后Barolet等[19]進(jìn)一步細(xì)化脈沖參數(shù)，使用630 nm、8 J/cm2光照研究了在單層培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞模型中使用各種脈沖或連續(xù)光傳輸模式對I型前膠原蛋白刺激的影響，結(jié)果顯示脈沖模式優(yōu)于連續(xù)模式，最佳脈沖參數(shù)為：脈沖持續(xù)時間(pulse duration) 100 μs，脈沖串間隔(pulse train interval) 750 μs，每串脈沖數(shù)(pulses per train) 4個，脈沖間隔(pulse interval) 1000 μs。但最佳組合參數(shù)仍有待評估。

2 黃光LED裝置

2.1 LED光源制備

本文設(shè)計(jì)并制作了一款參數(shù)可調(diào)的590 nm黃光LED裝置以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。該裝置可以改變驅(qū)動電源的占空比、頻率和功率，也即輻照度和輻照時間可調(diào)，具備6個可調(diào)頻率(10 Hz、50 Hz、100 Hz、250 Hz、500 Hz、1 000 Hz)和4個可調(diào)占空比(25%、50%、75%、100%)，并采用無極調(diào)光來調(diào)節(jié)輻照度。當(dāng)占空比改變時，該裝置的峰值輻照度將相應(yīng)改變，以保持恒定的平均輻照度，由此確保在相同照射時間內(nèi)，脈沖模式和連續(xù)模式的總劑量(J/cm2)相等。光源模塊采用小功率LED封裝器件，以11并17串的排布方式進(jìn)行表面貼裝，如圖1所示，PCB尺寸為200 mm×80 mm。單顆封裝器件額定功率為0.3 W，整個模塊的標(biāo)準(zhǔn)輸入電壓為36 V。考慮到用于光色電熱參數(shù)測試的積分球直徑較小，用30個相同規(guī)格的LED封裝器件串聯(lián)制作了一個小型LED光源模塊來測試光電參數(shù)，如圖2所示，PCB直徑為80 mm。測試模塊的PCB板材料與實(shí)驗(yàn)用LED器件相同，以確保散熱性能一致。

圖1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用LED光源模塊Fig.1 LED light source module for cell experiment

圖2 參數(shù)測量用LED光源模塊Fig.2 LED light source module for parameter measurement

2.2 LED光源的特征參數(shù)

常用溫度測量工具(如熱像儀和熱電偶)無法直接獲得LED芯片的PN結(jié)溫度(結(jié)溫)，因此我們采用正向電壓法間接測量結(jié)溫。其原理是在給定的小電流下，LED芯片或封裝器件的正向電壓和結(jié)溫之間存在近似線性關(guān)系。測量過程包括定標(biāo)和測量兩個步驟。

第一步定標(biāo)。將測試用LED光源模塊放入恒溫箱中，經(jīng)過約2 h的充分熱交換后可認(rèn)為結(jié)溫與恒溫箱溫度相同，對LED施加1 mA恒定小電流，利用結(jié)溫測試儀(上海力茲，LEDT-300B)測得此電流下串聯(lián)封裝器件的正向電壓；測定不同恒溫箱溫度下的正向電壓，可以獲得正向電壓與結(jié)溫的關(guān)系，由系統(tǒng)自動擬合成定標(biāo)曲線，該曲線在一定溫度范圍內(nèi)接近線性。

第二步測量。LED在設(shè)定好的大電流條件下工作，結(jié)溫測試儀會周期性地切斷工作電流，對LED光源模塊施加1 mA小電流，時間持續(xù)20 ms，測定瞬時正向電壓，根據(jù)定標(biāo)曲線可計(jì)算得出該工作電流下的結(jié)溫。

在測量結(jié)溫的同時，采用積分球和光譜儀測量LED模塊的光色參數(shù)，并測定電參數(shù)。參數(shù)測試用LED光源模塊貼裝在水套表面，使用恒溫循環(huán)水浴來模擬環(huán)境溫度。水浴溫度依次設(shè)定為45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃和85 ℃。LED模塊的輸入電流設(shè)定為0.03 A、0.075 A、0.15 A、0.3 A、0.45 A和0.6 A，分別對應(yīng)于額定電流的0.2、0.5、1、2、3、4倍。結(jié)溫與電流的關(guān)系如圖3所示，可見隨著輸入電流的增大，結(jié)溫幾乎線性增加。但即使輸入電流增加到額定值的3倍，結(jié)溫仍保持在140 ℃以下。因此，如散熱良好，封裝器件可實(shí)際工作在3倍額定功率而不損傷。

圖3 結(jié)溫與電流的關(guān)系Fig.3 The dependence of junction temperature on forward current

圖4為輻射功率與輸入電流的關(guān)系，可見在額定電流的3倍范圍內(nèi)，輻射功率隨輸入電流增加而增加。功率達(dá)到3倍以上時，輻射功率開始下降。隨著芯片內(nèi)熱量的不斷積累，結(jié)溫逐漸升高，將導(dǎo)致載流子逸流增加，從而降低器件的注入效率和發(fā)光效率。在實(shí)際使用中，輸入功率選擇應(yīng)小于額定值的三倍，并考慮輻射效率參數(shù)。

圖4 輻射功率與輸入電流的關(guān)系Fig.4 The dependence of radiant power on forward current

輻射效率是輻射功率與輸入功率之比。圖5所示為輻射效率隨電流的變化。當(dāng)輸入電流為額定值的0.5倍時，輻射效率最高，此后輻射效率幾乎呈線性下降。根據(jù)一般的設(shè)計(jì)要求，輻射效率必須達(dá)到10%以上。再考慮到工作溫度一般不高于45 ℃，合適的工作功率應(yīng)在額定功率的2倍以內(nèi)。

圖5 輻射效率與輸入電流的關(guān)系Fig.5 The dependence ofradiant efficiency on forward current

當(dāng)結(jié)溫變化時，LED芯片的峰值波長也會有所變化。當(dāng)輸入電流增加至2倍額定值時，PN結(jié)溫度上升約25～30 ℃，如圖3所示；峰值波長紅移約2 nm，如圖6所示。但相對而言，與熒光粉型LED相比，芯片型LED的波長一般偏移更小。

圖6 主波長與輸入電流的關(guān)系Fig.6 The dependence of dominant wavelength on forward current

2.3 恒定輻照度控制

通常當(dāng)照明模式由連續(xù)轉(zhuǎn)換為脈沖模式時，LED器件的平均輻照度將發(fā)生變化。例如，當(dāng)脈沖占空比從100% (連續(xù)光)變?yōu)?0%時，由于峰值輻照度保持不變，但導(dǎo)通時間減半，這將導(dǎo)致每個周期的平均輻照度減半。本實(shí)驗(yàn)過程中，保證了相同照射時間內(nèi)的總“劑量”相同，亦即平均輻照度相同。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的LED裝置能夠根據(jù)占空比自動改變峰值輻照度，例如當(dāng)占空比減半時峰值輻照度加倍，以確保平均輻照度不變。為了驗(yàn)證該控制功能，用分光光度計(jì)PLA-20 (遠(yuǎn)方光電，杭州)測定連續(xù)和脈沖(50%占空比，10 Hz)照射模式下的照度(lx)和輻照度(W/m2)。每種模式分別進(jìn)行三次測量取均值，如表1所示，連續(xù)光模式下的平均輻照度為171.8 W/m2，脈沖光模式的平均輻照度為169.5 W/m2。兩種模式的平均測量結(jié)果無明顯差異，在合理誤差范圍內(nèi)(<1%)，平均輻照度取6次測量的均值170.7 W/m2。

表1 連續(xù)和脈沖光的平均輻照度測量

*P>0.05, 無顯著差異。

3 生物實(shí)驗(yàn)

將人表皮黑素細(xì)胞(HEM)分別用20 J/cm2連續(xù)光(10 Hz，100%占空比)和20 J/cm2脈沖光(10 Hz，50%占空比)在距離2 cm處照射20 min，并與無光照(0 J/cm2)組進(jìn)行對比。為了避免來自光源的熱干擾，我們在照射前后測試了距離光源2 cm處的溫度，結(jié)果顯示溫度沒有變化。

3.1 細(xì)胞活性測量

實(shí)驗(yàn)評估了不同光照條件下的細(xì)胞活力。將HEM (每孔2×103個)一式三份接種到100 μl生長培養(yǎng)基中的96孔板中，分成3組并分別用不同光照條件。在照射24 h后，采用Cell Count Kit-8來處理樣本(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)，然后用Multiskan GO酶標(biāo)儀(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)測量波長450 nm處的每個孔的吸光度，從而測定細(xì)胞活力。

3.2 黑素含量測量

將原代培養(yǎng)的HEM (每孔5×105個)一式三份接種到100 μl生長培養(yǎng)基中的96孔板中，分成3組并分別采用不同光照條件。照射后24 h，將HEM在70 ℃條件下于1 N NaOH中溶解1 h，然后用Multiskan GO酶標(biāo)儀(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)通過波長475 nm處的吸光度測量相對黑色素含量。

3.3 酪氨酸酶活性測量實(shí)驗(yàn)

將原代培養(yǎng)的HEM (每孔5×105個)一式三份接種到100 μl生長培養(yǎng)基中的96孔板中，分成3組并用不同光照。照射后24 h，用PBS洗滌HEM，然后在4 ℃條件下在RIPA緩沖液中孵育30 min后進(jìn)行裂解。然后將100 ml裂解緩沖液接種到96孔板中。用Multiskan GO酶標(biāo)儀(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)測量波長630 nm處的吸光度。

3.4 實(shí)時熒光定量PCR

該實(shí)驗(yàn)旨在評估在不同光遞送下黑色素合成中3種顯著酶(即MITF，TRP-1和TYR)的mRNA表達(dá)。PCR擴(kuò)增使用MITF，TRP-1和TYR引物分別在以下條件進(jìn)行：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s40個循環(huán)，60 ℃ 34 s，95 ℃15 s，60 ℃ 1 min和95 ℃ 15 s。使用設(shè)備為DNA Thermal Cycler 9600 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)。

3.5 Western Blot免疫蛋白印跡

該實(shí)驗(yàn)旨在評估在不同光照下黑色素合成中3種顯著酶的蛋白質(zhì)表達(dá)。裂解HEM并通過RIPA緩沖液從HEM中提取蛋白質(zhì)。通過10% SDS-PAGE (EpiZyme, Shanghai, China)分離提取蛋白質(zhì)，然后電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore, Billerica, MA, USA)上。在室溫下在5%脫脂奶粉中孵育1小時以阻斷非特異性抗體結(jié)合后，使用來自Abcam (Cambridge, MA, USA)的一抗將膜在4 ℃溫育過夜，包括：抗MITF (ab59232; 1∶1000)，抗TYR (ab61294; 1∶1000)和抗TRP-1 (ab83774; 1∶500)。然后將膜與二抗在室溫下孵育1 h。通過增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Biodragon, Beijing, China)檢測免疫反應(yīng)條帶，并在LAS-3000發(fā)光圖像分析儀(Fujifilm, Tokyo, Japan)上顯影。使用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

3.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)單向ANOVA和Dunnett多重比較檢驗(yàn)以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在Graphpad Prism軟件(版本：7.05; GraphPad Software, San Diego, CA, USA)上進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)代表來自3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。結(jié)果的重要性在統(tǒng)計(jì)學(xué)中表示為P值。統(tǒng)計(jì)P值根據(jù)顯著性檢驗(yàn)方法獲得。通常，P<0.05被認(rèn)為是顯著的，P<0.01被認(rèn)為非常顯著，以此類推。其含義是由采樣誤差導(dǎo)致樣本之間出現(xiàn)差異的概率小于0.05或0.01。在第4節(jié)的圖中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.0001。

4 脈沖光和連續(xù)光對黑素細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 光源照射對細(xì)胞活性的影響

圖7為不同模式LED黃光照射后HEMs的細(xì)胞活性，數(shù)據(jù)表示為相對控制組變化的倍數(shù)，取三組重復(fù)試驗(yàn)平均值。結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著變化，即無論是連續(xù)光還是脈沖光，590 nm LED黃光照射對黑素細(xì)胞均不產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒性作用。

圖7 不同模式LED黃光照射后HEMs的細(xì)胞活性Fig.7 Cellular activity of HEMs with different modes of LED yellow light irradiation

4.2 脈沖及連續(xù)模式對細(xì)胞黑素成熟的影響

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步測量了連續(xù)和脈沖光照射對黑素生成的影響。黑色素是通過酪氨酸或3,4-二羥基苯丙氨酸的反應(yīng)形成的生物色素。因此，比較了有光和無光處理的HEMs細(xì)胞中的黑色素含量和酪氨酸酶活性。如圖8和圖9所示，經(jīng)過光照射后黑色素含量和酪氨酸酶活性均有降低。

結(jié)果顯示，連續(xù)光和脈沖光照射后，細(xì)胞黑色素含量(n=3，p<0.01)和酪氨酸酶活性(n=3，p<0.05)之間存在顯著差異。顯而易見地，脈沖光照對黑色素含量和酪氨酸酶活性具有更強(qiáng)的抑制作用。黑色素含量與黑素小體的成熟密切相關(guān)?？梢哉J(rèn)為，脈沖LED黃光照射比連續(xù)光更能抑制黑素小體的成熟。

圖8 不同模式LED黃光照射后細(xì)胞黑素含量Fig.8 Cellular melanin content with different modes of LED yellow light irradiation

圖9 不同模式LED黃光照射后細(xì)胞酪氨酸酶活性Fig.9 Tyrosinase activity with different modes of LED yellow light irradiation

4.3 脈沖及連續(xù)模式對細(xì)胞黑素合成的影響

接下來通過研究關(guān)鍵的黑素生成酶在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)，探討在連續(xù)和脈沖LED黃光照射條件下對黑素生成的影響。

(1) mRNA表達(dá)。如圖10所示，連續(xù)光(n=3，p<0.01)和脈沖光(n=3，p<0.0001)照射均對TYR的mRNA表達(dá)有顯著的抑制作用，其中脈沖光組的TYR mRNA表達(dá)與連續(xù)光組相比顯著降低(n=3，p<0.05)。

圖10 不同模式LED黃光照射后TYR mRNA表達(dá)Fig.10 TYR mRNA expression with different modes of LED yellow light irradiation

同樣地，如圖11所示，連續(xù)光(n=3，p<0.01)和脈沖光(n=3，p<0.0001)照射均對TRP-1的mRNA表達(dá)有顯著的抑制作用，其中脈沖光組的TRP-1 mRNA表達(dá)與連續(xù)光組相比顯著降低(n=3，p<0.05)。

圖11 不同模式LED黃光照射后TRP-1 mRNA表達(dá)Fig.11 TRP-1 mRNA expression with different modes of LED yellow light irradiation

然而，如圖12所示，MITF的mRNA表達(dá)在有無光照射的情況下未出現(xiàn)顯著變化。

圖12 不同模式LED黃光照射后MITF mRNA表達(dá)Fig.12 MITF mRNA expression with different modes of LED yellow light irradiation

(2) 蛋白質(zhì)表達(dá)。如圖13所示，連續(xù)光(n=3，p<0.05)和脈沖光(n=3，p<0.0001)照射均對TYR的蛋白表達(dá)有顯著的抑制作用，其中脈沖光組的TYR 蛋白表達(dá)與連續(xù)光組相比顯著降低(n=3，p<0.01)。

圖13 不同模式LED黃光照射后TYR 蛋白表達(dá)及免疫條帶Fig.13 TYR protein expression and immunological bands with different modes of LED yellow light irradiation

如圖14所示，脈沖光(n=3，p<0.01)照射對TRP-1的蛋白表達(dá)有顯著的抑制作用，脈沖光組的TRP-1 蛋白表達(dá)與連續(xù)光組相比顯著降低(n=3，p<0.05)。

圖14 不同模式LED黃光照射后TRP-1 蛋白表達(dá)及免疫條帶Fig.14 TRP-1 protein expression and immunological bands with different modes of LED yellow light irradiation

與mRNA表達(dá)相類似地，如圖15所示，MITF的蛋白表達(dá)在有或沒有光照射的情況下同樣未出現(xiàn)顯著變化。

圖15 不同模式LED黃光照射后MITF 蛋白表達(dá)及免疫條帶Fig.15 MITF protein expression and immunological bands with different modes of LED yellow light irradiation

綜上，經(jīng)過不同照射模式處理后，TYR、TRP-1、MITF的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平結(jié)基本一致，這些結(jié)果表明LED黃光照射能夠顯著抑制細(xì)胞內(nèi)黑色素生成，并且抑制效果強(qiáng)弱與光照占空比明顯相關(guān)。相同的頻率、照射強(qiáng)度和劑量下，50%占空比的脈沖光照在降低黑素生成方面更為有效。

5 討論

連續(xù)光和脈沖光如何影響細(xì)胞的機(jī)制尚未明確[26]。我們認(rèn)為，一方面，這主要是由于相應(yīng)疾病的差異和實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的可變氧化還原水平的不同，使得結(jié)論分析更為復(fù)雜。另一方面，除了單一變量外，其他照明參數(shù)的控制也發(fā)生了變化。例如，許多研究中沒有提到連續(xù)光照和脈沖光照條件下的平均輻照度是否保持一致。如要求平均輻照度相同，占空比50%的脈沖光的幅值是連續(xù)光的2倍。這一因素將直接影響在相同照射時間下的總劑量。因此，本實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格控制除占空比以外的其他可變因素，包括照射時間、平均功率、總劑量和脈沖頻率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與無光照組相比，連續(xù)光和脈沖光照射未顯著影響細(xì)胞活性。在這一前提下，進(jìn)一步探討了連續(xù)和脈沖兩種不同光照模式對于黑素體成熟和黑素生成過程的抑制作用。觀察到酪氨酸酶活性和黑素含量均在光照后降低，其中脈沖光照組的抑制作用更強(qiáng)，表明脈沖光照射下黑素體的抑制作用更強(qiáng)。此外，探討了與黑素合成相關(guān)的關(guān)鍵酶在經(jīng)過不同光照處理后基因和蛋白層面的表達(dá)，結(jié)果顯示，黑素合成過程中的兩種關(guān)鍵酶TYR和TRP-1的mRNA和相對蛋白表達(dá)受到脈沖光的抑制作用更強(qiáng)，表明50%占空比脈沖光相對連續(xù)光而言更能抑制黑素生成。

此前關(guān)于脈沖光和連續(xù)光功效討論主要有兩類研究：一類是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，一類是臨床人體實(shí)驗(yàn)。Brodon等[23]通過實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論：通過減輕皮膚黑色素的過濾效應(yīng)，脈沖光比連續(xù)光更能改善皮膚色素沉著，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這一過程不僅是由于過濾效果，而且黑色素的成熟和合成本身會受到脈沖光更強(qiáng)的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Barolet等[19]的結(jié)論一致，即脈沖光照射擁有更好的治療效果。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，更加注重光源平均輻照度的控制，嚴(yán)格確保除占空比以外其他所有的變量(照射時間、平均輻照度、總劑量、頻率、溫度等)保持一致。此外除了目標(biāo)物質(zhì)含量(黑色素)，進(jìn)一步探索了幾種影響黑色素合成的關(guān)鍵酶在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)，試圖通過此研究光照對黑色素含量的影響機(jī)制。

至于為什么脈沖光照射模式要優(yōu)于連續(xù)光照模式，目前有幾種可能的解釋，主要包括：

1) 細(xì)胞可能需要時間用來吸收和處理光子[19]，以及避免細(xì)胞耗盡[24]，靶向分子/細(xì)胞可能有其自身特定的熱弛豫時間。

2) 脈沖光照可能增強(qiáng)NO解離和ROS爆發(fā)[25]，從而增加線粒體的能量產(chǎn)生以參與細(xì)胞活動。

3) 可能存在通過“孔”的光的局部場增強(qiáng)，并且在特定頻率下的脈沖光輸出可減輕光吸收效應(yīng)，導(dǎo)致更多的能量到達(dá)靶細(xì)胞[23]。

本實(shí)驗(yàn)中脈沖光比連續(xù)光更能抑制黑素合成，可能有以下的原因：

1) 脈沖光在轉(zhuǎn)錄水平層面以抑制TYR和TRP-1 mRNA合成的方式影響黑色素合成。

2) 脈沖光可能抑制黑素合成反應(yīng)的關(guān)鍵酶和相關(guān)蛋白質(zhì)的合成。

在這兩種方式中，可以提出假設(shè)，在基因轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)合成過程中可能存在“極限輻照度”。在實(shí)際輻照度高于極限輻照度的情況下，連續(xù)模式在同樣的時間內(nèi)能夠提供更多能量，加快轉(zhuǎn)錄或合成的反應(yīng)速度。

3) 酶的半衰期和脈沖持續(xù)時間之間可能存在某種重合，從而在瞬時功率更高的脈沖照射下，蛋白分解過程加快，TYR和TRP-1家族蛋白的含量降低，進(jìn)一步影響黑素的合成過程。

此外值得注意的是，盡管TYR和TRP-1在無光、連續(xù)光和脈沖光模式之間具有顯著差異，但MITF表達(dá)沒有顯示出顯著變化。這可能是由于因?yàn)門YR和TRP-1直接的基因和蛋白表達(dá)直接受到光照影響，同時作為MITF的靶基因，TYR和TRP-1的編碼基因直接受MITF調(diào)節(jié)，但相反的通路是否成立，即TYR和TRP-1表達(dá)是否影響MITF的表達(dá)，可能有待研究。

6 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)并制造了一個590 nm的黃光LED裝置，能夠在連續(xù)和脈沖模式下保持平均輻照度不變。實(shí)驗(yàn)評估了不同光照條件下黑色素合成中的3種關(guān)鍵黑色素酶TYR/TRP-1/MITF的細(xì)胞活力、酪氨酸酶活性、mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，用來比較連續(xù)和脈沖光照射對黑素體的成熟和黑色素合成的影響。

結(jié)果顯示連續(xù)和脈沖LED光照處理顯著抑制了黑色素合成，其特征表現(xiàn)在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的TYR和TRP-1表達(dá)降低。與連續(xù)模式相比，脈沖光照射對黑色素合成具有更好的抑制作用，表現(xiàn)為更低的TYR和TRP-1基因和蛋白表達(dá)。由此得出結(jié)論，通過影響TYR和TRP-1 mRNA合成的轉(zhuǎn)錄水平以及通過合成或降解關(guān)鍵酶和相關(guān)蛋白，脈沖光能夠更有效地抑制黑色素合成。

致謝:陳力主治醫(yī)師支持和指導(dǎo)了本文的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。上海力茲照明電氣有限公司制作了黃光LED裝置。在此表示感謝。