陳橋橋 涂仕娟 夏修文 丁 斗,2 楊紅亞

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610075；2.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中醫(yī)系，貴州 遵義 563002

外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMV)是由革蘭氏陰性細(xì)菌釋放的一種特定的生理結(jié)構(gòu)，其為納米級大小、球形、雙層膜包裹的，內(nèi)含生物活性蛋白、脂質(zhì)、核酸和代謝物的囊泡狀結(jié)構(gòu)。幾乎所有的革蘭氏陰性細(xì)菌均能產(chǎn)生外膜囊泡[1-2]，但物種的多樣性使它們在包膜結(jié)構(gòu)和組成上存在一定的差異性[3-4]。OMV的釋放可去除細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)不必要的物質(zhì)，同時(shí)也是細(xì)菌抵御外界應(yīng)激壓力的一種手段，這對細(xì)菌的存活至關(guān)重要[5-6]。OMV的脫落被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊的一種普遍機(jī)制，通過OMV釋放將其攜帶的貨物遞送到其他細(xì)菌或真核細(xì)胞中，從而在細(xì)胞相互作用中發(fā)揮多種關(guān)鍵作用，如營養(yǎng)攝取、抗菌防御、水平基因轉(zhuǎn)移、生物膜形成以及毒力因子遞送等[1,7-8]。OMV作為免疫刺激劑被認(rèn)為是一種有前景的疫苗成分，OMV相關(guān)疫苗的開發(fā)近年來受到廣泛的關(guān)注[1,7,9,35]。細(xì)菌正常生長和受應(yīng)激時(shí)，都會釋放OMV，但其發(fā)生機(jī)制目前尚不清楚。了解OMV的生物發(fā)生機(jī)制及其影響因素，對充分認(rèn)識OMV在細(xì)菌生理學(xué)、致病機(jī)制及相關(guān)疫苗研發(fā)中具有重要意義。

1 OMV生物發(fā)生模型的提出

目前，關(guān)于OMV的生物發(fā)生機(jī)制研究主要集中于以下幾種模型。

1.1 外膜與肽聚糖間交聯(lián)的減少

革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁由外膜(OM)和肽聚糖(PG)組成，周質(zhì)間隙位于細(xì)胞膜(內(nèi)膜)和外膜間，周質(zhì)間隙內(nèi)的一薄層肽聚糖連接內(nèi)外兩層膜。Lpp是含量豐富的外膜脂蛋白，共價(jià)交聯(lián)OM和PG層，維持包膜結(jié)構(gòu)的完整性。當(dāng)PG分解-合成平衡改變時(shí)，局部Lpp-PG交聯(lián)被破壞，外膜的一小部分向外凸出，導(dǎo)致囊泡的產(chǎn)生[10-11]。Schwechheimer C等[10]發(fā)現(xiàn)OMV的產(chǎn)生受PG重塑和Lpp-PG交聯(lián)的調(diào)節(jié)，且 OMV的產(chǎn)生水平與Lpp-PG交聯(lián)呈反比關(guān)系。大腸桿菌nlpI突變體在產(chǎn)生高水平OMV時(shí)，共價(jià)OM-PG交聯(lián)率明顯降低(P<0.05)[11]。這些觀察均支持一個(gè)模型，即OMV在OM-PG交聯(lián)水平局部降低的位點(diǎn)出芽。

1.2 周質(zhì)間隙中錯(cuò)誤折疊蛋白或包膜成分的累積

Schwechheimer C等[10]同時(shí)也發(fā)現(xiàn)OMV產(chǎn)生并不完全取決于Lpp-PG交聯(lián)。在一些高囊泡性菌株中，OMV產(chǎn)生與Lpp-PG交聯(lián)之間并不呈反比關(guān)系，而在細(xì)菌周質(zhì)間隙中出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊蛋白或包膜成分的積累，他們推測囊泡的產(chǎn)生是由這些材料的累積引起的[10]。Mcbroom A J等[6]的研究表明囊泡釋放的量與包膜中蛋白積累的水平直接相關(guān)，且在細(xì)胞的正常管家和應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制受損時(shí)積累加劇。這些物質(zhì)積聚在周質(zhì)間隙的某些區(qū)域后，將外膜向外擠出而出芽，從而去除不需要的細(xì)胞成分。

1.3 脂質(zhì)A修飾引起的LPS重塑

革蘭氏陰性細(xì)菌的OM雙層脂質(zhì)組織為獨(dú)特的不對稱結(jié)構(gòu)，內(nèi)部小葉和外部小葉分別由甘油磷脂(PL)和LPS構(gòu)成，脂質(zhì)A是LPS生物活性的主要組分[12]。Wael E等[13]發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)A脫酰酶PagL的表達(dá)引起囊泡增多，而pagL突變株的OMV合成減少，且較之OM，僅OMV中出現(xiàn)脫酰脂質(zhì)A的積累。Bonnington K E等[14]激活PhoP / Q-和PmrA / B系統(tǒng)，同時(shí)誘導(dǎo)向OM添加修飾的LPS物種后，OMV產(chǎn)量增加，且直徑增大[14]。OM中具有共價(jià)修飾的脂質(zhì)A物種被保留，而棕櫚?；|(zhì)A物種選擇性喪失[14]。這些證據(jù)表明OMV生物發(fā)生的機(jī)制涉及脂質(zhì)A修飾引起外膜重塑，導(dǎo)致外膜彎曲和隨后的OMV形成。

1.4 內(nèi)部或外部小葉脂質(zhì)的富集

Kolds H等[15]提出脂質(zhì)聚集與膜曲率相關(guān)，特定脂質(zhì)的聚集會導(dǎo)致OM雙層表面的局部彎曲。球體的曲率為半徑的倒數(shù)，細(xì)菌若要形成高度彎曲的OMV，其不對稱OM小葉的曲率必須增大很多倍?；诖耍珿ui M J等[16]提出細(xì)菌形成OMV，必須在OMV的內(nèi)部和外部小葉之間，形成具有較大差異的脂質(zhì)的量或類型，并證明這能通過上調(diào)內(nèi)/外部單側(cè)小葉脂質(zhì)的產(chǎn)生來實(shí)現(xiàn)。OM外表面選擇性富集具有適應(yīng)曲率能力的A-LPS和CTD-家族蛋白，A-LPS的去?；M(jìn)一步增加曲率，導(dǎo)致OM局部向外彎曲形成OMV[16]。內(nèi)部或外部小葉脂質(zhì)的富集，可能導(dǎo)致單層區(qū)域的不對稱，從而增加整個(gè)雙層的固有曲率，導(dǎo)致膜彎曲。

1.5 其他模型

除上述模型外，有關(guān) OMV生物發(fā)生還提出了以下幾種模型。(1)假單胞菌喹諾酮信號(PQS)的膜分布調(diào)節(jié)模型。Florez C等[17]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌PQS輸出與OMV產(chǎn)量密切相關(guān)，同時(shí)還檢測到OMV釋放少的菌株隔離了內(nèi)膜中大部分PQS。這表明OMV形成與PQS信號輸出有關(guān)，PQS嵌入外膜導(dǎo)致外部小葉擴(kuò)張，由此引起曲率并最終形成OMV[17]。Horspool A M等[18]證實(shí)小分子PQS誘導(dǎo)OMV生物發(fā)生是一個(gè)廣泛保守的過程。(2)磷脂(PL)在OM外部小葉的累積產(chǎn)生OMV。有證據(jù)表明PL轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對于維持OM脂質(zhì)不對稱必不可少[12,19]。Sandro R等[20]報(bào)道VacJ / Yrb ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(一種擬議的PL轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)參與了OMV的生物發(fā)生。PL轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變體的OMV中富含PL[20-21]。磷脂在OM外部小葉中不對稱擴(kuò)張引起OM向外膨脹，導(dǎo)致OMV的產(chǎn)生。(3)Hampton C M等[22]發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌OMV是以與莢膜多糖(CPS)相關(guān)的空間差異方式產(chǎn)生。他們觀察到野生型創(chuàng)傷弧菌OMV在細(xì)胞周圍形成一系列平面同心環(huán)，并與膜保持約200 nm的間距，透射電子顯微鏡顯示OMV邊緣有厚約100 nm的莢膜存在，SPRF進(jìn)一步揭示多糖鏈之間端對端相互作用，維持細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-OMV以及OMV-OMV之間觀察到的200 nm間距[22]。

2 影響OMV生物發(fā)生的因素

OMV的產(chǎn)生并不是膜簡單剪切的物理過程，而是一種將生物分子分選到OMV中的能量消耗過程[16]。盡管OMV生物發(fā)生的分子機(jī)制還不是非常清楚，但已有大量的證據(jù)表明，OMV的生物發(fā)生受到細(xì)菌生長條件和遺傳因素的影響。

2.1 生長條件

細(xì)菌OMV的產(chǎn)生是一種受環(huán)境控制的特定的分泌過程。物理刺激如高溫、滲透壓等，生化刺激如抗生素、環(huán)氧化物等，以及限制生長所需的營養(yǎng)元素如氧氣、氨基酸等，均會對OMV的生成產(chǎn)生一定的影響[3]?？股貙MV產(chǎn)生的影響涉及產(chǎn)量、尺寸、毒力因子及蛋白成分等多方面[23-24]。反過來，OMV通過這些改變在抗生素應(yīng)激下對細(xì)菌起到防御保護(hù)作用[25]。Chan K等[26]發(fā)現(xiàn)鐵限制會導(dǎo)致OMV蛋白質(zhì)組顯著變化。有研究表明外膜囊泡在鐵限制條件下可充當(dāng)鐵供體[27]。這也揭示了囊泡在鐵獲取中的重要作用，這對于宿主的存活是至關(guān)重要的。值得注意的是，細(xì)菌產(chǎn)生OMV并不限于特定的生長條件，在宿主體內(nèi)也會產(chǎn)生；也并非受應(yīng)激才生成，即使在沒有外部應(yīng)力的情況下，OMV也要釋放。

2.2 遺傳因素

OMV生成和內(nèi)容物選擇是受基因調(diào)控的，并不是隨機(jī)發(fā)生或細(xì)胞死亡的結(jié)果[2]。在大腸桿菌OMV表型的轉(zhuǎn)座子突變體篩選中，發(fā)現(xiàn)nlpA突變體比野生型產(chǎn)生更少的OMV， 而degP、nlpI突變體產(chǎn)生更多的OMV[5,11]。degQ基因缺失可增強(qiáng)奧奈達(dá)湖桿菌OMV產(chǎn)生[28]。virK基因突變導(dǎo)致志賀氏菌OMV的溫度依賴性過量產(chǎn)生[29]。變形鏈球菌分選酶A缺乏引起突變膜囊泡的蛋白質(zhì)譜發(fā)生改變[30]?；魜y弧菌OmpA突變體比野生型釋放更多的OMV[31]。fumA和tktA突變導(dǎo)致土拉弗朗西斯菌OMV產(chǎn)生的嚴(yán)重缺陷[32]。這些研究均表明OMV生物發(fā)生可以在遺傳水平上進(jìn)行調(diào)控。

OMV生物發(fā)生影響因素的研究，提示外膜囊泡對細(xì)菌存活的重要作用。關(guān)于目前OMV生物發(fā)生的模型，需作出以下幾點(diǎn)說明：首先，每種模型都是在對一種或幾種細(xì)菌OMV研究的基礎(chǔ)上提出的，此細(xì)菌物種成立的模型并不一定適用于彼物種，正如莢膜多糖調(diào)控OMV生物發(fā)生的機(jī)制，目前為止僅在創(chuàng)傷弧菌野生型菌株中觀察到；其次，同一細(xì)菌OMV的生物發(fā)生可能不止對應(yīng)一種模型，可能存在OMV生物發(fā)生的多種途徑，比如檢測到異質(zhì)囊泡的某些物種[33-34]；最后，現(xiàn)有的發(fā)生模型未能涵蓋全部革蘭氏陰性菌OMV的生物發(fā)生機(jī)制，其還有待進(jìn)一步的研究和深入。

OMV納米級大小、堅(jiān)固的雙層結(jié)構(gòu)以及遠(yuǎn)距離遞送活性分子等特點(diǎn)，賦予了它被用于疫苗開發(fā)的可能。大量證據(jù)表明OMV作為針對廣泛細(xì)菌感染的疫苗，具有很大的潛力[35]。然而，對OMV生物發(fā)生認(rèn)識的不足限制了對它的大規(guī)模生產(chǎn)，且病原體衍生的OMV的過度毒性阻礙了它們的臨床應(yīng)用。因此，許多研究專注于囊泡工程化設(shè)計(jì)，以便OMV能更好地遞送藥物和抗原，從而改進(jìn)目前的抗菌藥物治療方法?？傊锾m氏陰性菌OMV的生物發(fā)生，關(guān)系到未來新抗生素或基于OMV的疫苗開發(fā)。揭示OMV生物發(fā)生的機(jī)制，將促進(jìn)OMV生物工程在生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。關(guān)于OMV的形成及其產(chǎn)生水平和內(nèi)容物選擇間關(guān)系等，雖然還存在諸多問題，但進(jìn)一步探索具有良好特征的模型系統(tǒng)，可能會在未來有所見解。