1.大理大學(xué)藥物研究所，云南 大理 671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000

黃芪為滋補(bǔ)類傳統(tǒng)中藥，性微溫、味甘，主要含黃芪皂苷類、多糖類和黃酮類生物活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、促進(jìn)機(jī)體代謝和抗疲勞等作用，在抗腫瘤、抗病毒等方面也有顯著功效[1-4]。黃芪藥材原植物為黃芪屬植物膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.或蒙古黃芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao[5]，這兩種植物在云南無天然分布。然而，由于云南在地理、氣候等方面的多樣性，致使該地區(qū)黃芪屬植物種類十分豐富，許多分布于云南的黃芪屬植物在民間被當(dāng)作草藥廣泛應(yīng)用，部分種類甚至被用作正品黃芪代替品[1]。其中，在《中華本草》上稱之為“野黃芪”的長果頸黃芪(A.englerianus)就被認(rèn)為具有與黃芪相似的功效[1]。長果頸黃芪主要分布于云南和西藏東南部，生于海拔2000～3700米的山坡林緣，是少數(shù)幾個(gè)在大理及周邊地區(qū)具有廣泛分布的黃芪屬植物之一。民間調(diào)研發(fā)現(xiàn)，大理白族地區(qū)亦將其代黃芪藥用，但對其現(xiàn)代研究認(rèn)識卻非常有限。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，該植物富含具有殺寄生蟲和抗氧化活性的黃酮等酚性成分，以及甾醇類化合物[6-9]。另據(jù)報(bào)道，黃芪多糖是黃芪的有效成分之一，現(xiàn)代藥理研究表明其具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、改善心血管功能、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗動脈粥樣硬化、降血脂、肝保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)以及治療糖尿病等作用[10,11]。為進(jìn)一步考察長果頸黃芪藥用品質(zhì)相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)，本文采用硫酸-蒽酮法對其多糖含量進(jìn)行了測定，為更好地開展白族藥用植物研究以及開發(fā)長果頸黃芪資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 UV-T6紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用有限責(zé)任公司)；80-2臺式低速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司手術(shù)器械廠)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

葡萄糖(批號：XK13-001-2001-164II，成都化學(xué)試劑廠)；濃硫酸(批號：XK13-201-00370 008II重慶川東化工(集團(tuán))有限公司化學(xué)試劑廠)；蒽酮(批號：20071101，上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)五聯(lián)化工廠)。

長果頸黃芪(AstragalusenglerianusUlbr.)的根于2011年11月采自云南大理蒼山，由中國科學(xué)院昆明植物研究所向春雷博士鑒定，植物標(biāo)本(20100928-1b)存放于大理大學(xué)藥物研究所。8個(gè)正品黃芪樣品(見表1)2011年7月購于大理白族自治州主要藥材銷售公司，經(jīng)大理大學(xué)周濃副教授、肖朝江博士鑒定為正品黃芪基原植物之一膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge。

表1 8個(gè)市售黃芪樣品來源一覽表

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制 精密稱定 105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品 25 mg，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加水至刻度并搖勻，得對照品溶液(0.1 mg/mL)。

1.2.2 硫酸蒽酮試液的配制 精密稱取蒽酮 0.5 g，加80%的硫酸溶液500 mL使溶解，搖勻，即得。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，置10 mL具塞試管中，加水至2.0 mL，精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL，搖勻，置水浴中加熱15min，取出，放入冰浴中冷卻15min，以相應(yīng)試劑為空白對照，照紫外-可見分光光度法，在625 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 供試品溶液的配制 分別精密稱取上述黃芪樣品約2 g，精密稱定，置索氏提取器中，加水80 mL，熱回流提取至提取液無色，提取液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取20 mL，加入乙醇180 mL，搖勻，4 ℃放置12 h，取出，離心10 min(3000 r/min)，傾去上清液，沉淀再加適量乙醇反復(fù)洗滌、離心2次，最后加水溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，再精密量取上述溶液10 mL至50 mL容量瓶中，加水定容搖勻，即得。

1.2.5 含量測定 精密量取供試品樣品溶液各 2 mL，分別置10 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的重量，計(jì)算，即得(多糖含量以無水葡萄糖計(jì))。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及其回歸方程的建立 按上述實(shí)驗(yàn)方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。以吸光度值對葡萄糖濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y=0.033x-0.0148(2.5～25μg/mL，r=0.9991)；表明方程的線性非常好。

2.2 長果頸黃芪和8個(gè)正品黃芪樣品多糖含量 按上述實(shí)驗(yàn)方法測得9個(gè)黃芪樣品中的多糖含量如表2所示，所有正品黃芪樣品的多糖含量均在4%以下，而大理野生的長果頸黃芪的多糖平均含量卻高達(dá)15.44%。多樣本均數(shù)兩兩比較的單因素方差分析(α=0.05，SPSS，版本19.0)結(jié)果表明：樣品2和8之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；樣品3、5和7之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；這兩組樣品之間以及與其他樣品之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一黃芪樣品，按“1.2.4”和“1.2.5”項(xiàng)下方法，重復(fù)測定6次，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的量，計(jì)算得RSD為0.12%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一黃芪樣品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法顯色，分別在0、10、20、30、40、50、60、120 min時(shí)測定吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，計(jì)算得RSD為0.26%，表明樣品溶液在2 h內(nèi)非常穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一黃芪樣品約1 g，按樣品制備方法制備供試品溶液6份，各取1 mL，分別置6個(gè)10 mL具塞試管中，每管再精密加入對照品溶液1.0 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的重量，計(jì)算回收率(見表3)。樣品回收率為95.94%，RSD為1.19%，表明本法準(zhǔn)確可行。

表2 黃芪樣品多糖含量測定結(jié)果

注：9和10為兩批次長果頸黃芪。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白族藥用植物長果頸黃芪根多糖平均含量高達(dá)15.44%，與正品黃芪(平均2.81%)差異十分顯著，約5.5倍于正品黃芪。僅從多糖含量角度來看，大理野生長果頸黃芪的品質(zhì)可能優(yōu)于正品黃芪。但多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此該差異是否能影響黃芪的正常功效，有待進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)大理州市售黃芪的多糖含量在1.81%～3.86%之間，表明各銷售公司的黃芪在品質(zhì)上存在一定差異。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

另外，本實(shí)驗(yàn)采用的方法為《中國藥典》靈芝項(xiàng)下用于靈芝多糖含量測定的硫酸-蒽酮法[5]。研究結(jié)果表明該法在測定黃芪多糖含量測定中顯示出較高的精密度，以及較好的穩(wěn)定性和回收率，因此該法亦可用于黃芪藥材、炮制品以及含黃芪制劑的多糖含量控制。