何玉濤1 林凡友* 卞常芝 秦承盟

1.仁和堂藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 276600；2.翔宇藥業(yè)股份有限公司，山東 臨沂 276023

保心寧膠囊是由丹參、當(dāng)歸和枳殼的干浸膏及三七4味藥組成，具有活血化瘀、行氣止痛之功效。臨床上用于心絞痛、心律失常，改善冠心病癥狀等[1]。本產(chǎn)品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十一冊(cè)藥品標(biāo)準(zhǔn)，檢驗(yàn)項(xiàng)目極其簡單，沒有含量檢測等定量控制指標(biāo)。為了更好地控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，定量定性檢測有效成分，特對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高。研究表明丹參具有較強(qiáng)的藥理作用[2-3]，多以治療心血管系統(tǒng)疾病為主，主要成分為丹參酮IIA、丹參素等，為準(zhǔn)確控制藥品質(zhì)量，用甲醇提取有效成分，高效液相檢測，進(jìn)行丹參含量測定。三七、枳殼分別增加薄層鑒別檢查項(xiàng)，定性檢測其成分，為控制產(chǎn)品質(zhì)量提供更有效措施。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，MS105DU型電子天平。丹參對(duì)照藥材(批號(hào)120923-201615)；枳殼對(duì)照藥材(批號(hào)120981-201605)；丹參酮IIA對(duì)照品(批號(hào)110766-201721)；人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào)110754-201324)；三七皂苷R1對(duì)照品(批號(hào)110745-201318)對(duì)照品均來源于中國食品藥品檢定研究院，甲醇、乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。保心寧膠囊樣品來源于翔宇藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)為150101、150302、150401、150402、150403、150902、160503、161001、161102、170302。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 三七 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，稱取1.0g，加甲醇15mL，超聲處理1h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取人參皂苷Rg1對(duì)照品、三七皂苷R1對(duì)照品，加甲醇制成每1mL各含2mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-正丁醇-甲醇-水(2∶4∶1∶2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10% 硫酸乙醇溶液，在105℃加熱數(shù)分鐘。供試品色譜圖中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)，而陰性供試品溶液在相應(yīng)位置無斑點(diǎn)。

2.1.2 丹參 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，稱取4.0g，加甲醇40 mL，加熱回流提取1 h，放冷，濾過，濾液揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取丹參酮IIA 1.0 g、丹參對(duì)照藥材1.0 g，同法制成對(duì)照品及對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮(95∶5)為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視。供試品色譜圖中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性供試品溶液在相應(yīng)位置無斑點(diǎn)。

2.1.3 枳殼 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.5 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取枳殼對(duì)照藥材0.2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，在105 ℃加熱約5 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜圖中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性供試品溶液在相應(yīng)位置無斑點(diǎn)。見圖1。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為 thermo C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水=(325∶100∶125)，檢測波長270 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫為室溫25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按丹參酮IIA峰計(jì)不低于3000。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物適量，研細(xì)，稱取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率140 W，頻率42kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取丹參酮IIA對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成高濃度的對(duì)照品儲(chǔ)備液，取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量再加甲醇稀釋至每1 mL約含15 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2.3 陰性供試品溶液制備 取除丹參外的其余處方量藥材，按制備工藝方法制備缺丹參的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成缺丹參的陰性樣品溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中測定。結(jié)果表明理論板數(shù)按丹參酮IIA峰計(jì)算大于3000，丹參酮IIA和樣品中其它組分峰可基線分離，且與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5；陰性供試品溶液對(duì)主峰檢測無干擾，表明該方法專屬性良好。如圖2所示。

2.2.4 線性試驗(yàn) 精密吸取丹參酮IIA對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液適量，分別加甲醇稀釋成濃度為3.62 μg·mL-1、7.24 μg·mL-1、14.48 μg·mL-1、18.1 μg·mL-1、21.72 μg·mL-1、28.96 μg·mL-1的溶液，分別精密吸取10μL，注入高效液相色譜儀，測定其峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：A=60.395C-20.83，r=0.9998。結(jié)果表明丹參酮IIA在3.62～28.96 μg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果表明：丹參酮IIA的峰面積的RSD為0.22%，表明該方法的系統(tǒng)精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將150402批供試品溶液于室溫條件下放置12h，分別于0、1、2、4、6、8、12h精密量取10μL注入液相色譜儀測定。結(jié)果表明，在室溫條件下放置12h內(nèi)，所得丹參酮IIA的峰面積的RSD為0.29 %，供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好，保心寧膠囊的丹參酮IIA含量為0.22mg·粒-1。

2.2.7 回收率試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：150402，含量為0.22 mg·粒-1，每粒0.45g)，設(shè)計(jì)高、中、低3個(gè)不同濃度，高、中、低濃度丹參酮IIA對(duì)照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1.5∶1、1∶1、0.5∶1，各分別制備3份供試品溶液進(jìn)行測定。結(jié)果見表1，丹參酮IIA的平均回收率為98.81%，RSD為2.55%。

表1 回收率測定結(jié)果 (n=9)

2.2.8 耐用性試驗(yàn) 分別使用正常色譜條件，不同柱溫(25±5)℃、不同波長(270±2)nm、不同流速(1.0±0.1) mL·min-1、不同流動(dòng)相比例、不同色譜柱thermo C18 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)、Agilent C18 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)進(jìn)行測試，分別計(jì)算對(duì)丹參酮IIA含量進(jìn)行考察。結(jié)果所有丹參酮IIA含量的RSD為1.54%，含量耐用性較好。

2.2.9 樣品含量測定 測定10批保心寧膠囊，依次吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液10 μL，注入高相液相色譜檢測丹參酮IIA含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

從以上10批保心寧膠囊樣品的含測結(jié)果可知，每粒樣品中丹參酮IIA的含量范圍為0.19～0.29 mg，考慮到丹參藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)、工業(yè)大生產(chǎn)中有效成分轉(zhuǎn)移率、有效成分穩(wěn)定性等因素對(duì)樣品中丹參酮IIA含量的影響，為保證產(chǎn)品在有效期內(nèi)有效成分含量符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，暫定每粒樣品中含丹參以丹參酮IIA計(jì)不得少于0.12 mg。

3 討論

3.1 TLC鑒別 在保心寧膠囊原有標(biāo)準(zhǔn)中，鑒別項(xiàng)僅規(guī)定了最大吸收波長及一個(gè)顯色鑒別，不能準(zhǔn)確控制產(chǎn)品有效成分，經(jīng)查閱文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)保心寧膠囊中的三七、丹參和枳殼都增加了TLC鑒別項(xiàng)。分別查閱不同文獻(xiàn)[4-6]研究不同的展開劑對(duì)鑒別的影響，考察高溫高濕等條件對(duì)TLC方法進(jìn)行耐用性驗(yàn)證，制定最有效的鑒別方法，經(jīng)考察陰性供試品對(duì)樣品的定性鑒別無干擾，該方法的專屬性較強(qiáng)。

3.2 含量檢測 丹參為方中君藥，主要成分為丹參酮IIA、丹參素等，因此將丹參中丹參酮IIA作為本品質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。本文以甲醇為提取劑，采用高效液相色譜法測定丹參中丹參酮IIA含量。采用紫外分光光度計(jì)對(duì)丹參酮IIA溶液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果在270nm波長處有最大吸收，故選擇270nm作為本品的測定波長。分別考察甲醇-乙腈-水(325∶100∶125)、甲醇-水(75∶25)為流動(dòng)相，結(jié)果以甲醇-乙腈-水(325∶100∶125)為流動(dòng)相時(shí)，丹參酮IIA峰形對(duì)稱，分離度大于1.5，理論板數(shù)大于3000，故確定甲醇-乙腈-水(325∶100∶125)為流動(dòng)相。該方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，丹參酮IIA在3.62～28.96μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為98.81%，耐用性RSD為1.54%，對(duì)10批樣品含量進(jìn)行檢測結(jié)果穩(wěn)定，說明該方法準(zhǔn)確度高，耐用性強(qiáng)，能有效控制保心寧膠囊的質(zhì)量。

綜上所述，采用高效液相色譜法對(duì)保心寧膠囊中丹參酮IIA含量進(jìn)行檢測，專屬性好，準(zhǔn)確度高；并對(duì)處方中的三七、丹參和枳殼都增加了鑒別項(xiàng)進(jìn)行定性控制，能有效控制保心寧膠囊的質(zhì)量，對(duì)保心寧膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定有一定提升作用。