內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市食品藥品檢驗檢測中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060

大菟絲子CuscutajaponicaChoisy.又名日本菟絲子，為旋花科菟絲子屬植物金燈藤的干燥成熟種子。秋季果實成熟時采收植株，曬干，打下種子，除去雜質(zhì)，即可，為少數(shù)民族藥材，不得代替菟絲子，藥用時應分別入藥[1]?！秲?nèi)蒙古中藥材標準》(1988年版)和《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》(2003年版)均收載該品種，大菟絲子性辛、甘、平，具有補肝腎、益精髓、明目的作用，可用于腰膝酸痛、遺精、消渴、目暗、尿頻、淋瀝?！秲?nèi)蒙古中藥材標準》中收錄大菟絲子質(zhì)量標準僅制定了[性狀]和[檢查]項[1]，《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》收錄的大菟絲子也缺少指標成分作為含量控制項目[2]，根據(jù)文獻報道[3-4]，大菟絲子含黃酮類化合物、甾類化合物和有機酸等，有機酸主要含有咖啡酸和綠原酸，其中綠原酸具有抗病毒、保肝利膽作用。瞿燕等[4]利用HPLC 法建立了大菟絲子生品和炮制品的特征圖譜，探討大菟絲子炮制前后化學成分的變化規(guī)律，并未對大菟絲子中綠原酸含量測定方法做系統(tǒng)性研究。馮華等[5]對黔產(chǎn)大菟絲子中綠原酸含量進行了測定，樣本收集僅限于貴州地區(qū)，而大菟絲子分布于我國南北各省，越南、朝鮮、日本也有[6]。本實驗采用高效液相色譜法對國內(nèi)不同產(chǎn)地及韓國、朝鮮的9批次大菟絲子中的綠原酸含量進行測定，考察不同產(chǎn)地大菟絲子中綠原酸的含量差異，為提高和完善大菟絲子的質(zhì)量標準提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀，PDA檢測器；島津UV-2450紫外分光光度計；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器。

綠原酸對照品(批號：110753-201716；中國食品藥品檢定研究院)；大菟絲子為包頭市食品藥品檢驗檢測中心收集制備并確定基源。乙腈為色譜純；水為高純水；其他試劑均為分析純。

表1 樣品來源信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 采用SHIMADZU VP-ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.05%磷酸溶液(10∶90)為流動相進行流動相條件摸索，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進樣量10 μL。綠原酸峰的理論塔板數(shù)均大于7000，與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取綠原酸對照品10.55 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液10 mL置100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為21.10 μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取大菟絲子粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇水混合溶劑補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 采集波長的確定 取對照品溶液置于紫外分光光度計上，在210～350 nm波長范圍掃描。結(jié)果表明綠原酸在327 nm的波長處有最大吸收，故選擇327 nm作為其含量測定的檢測波長，后續(xù)方法學考察結(jié)果也表明在該波長下測定數(shù)據(jù)穩(wěn)定、可靠。典型色譜圖如圖1和圖 2所示。

圖1 綠原酸對照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

2.4 線性關系考察 準確稱取綠原酸對照品10.55 mg，置50 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液(211.0 μg/mL)，分別精密量取儲備液0.5 mL、1 mL、2 mL、2.5 mL、1 mL、1 mL、2 mL、2.5 mL置200 mL、100 mL、100 mL、50 mL、10 mL、5 mL、5 mL、5 mL量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，得到系列濃度見表2，分別測定，以峰面積為縱坐標，綠原酸濃度為橫坐標，進行回歸分析，回歸方程為：y=34310x-38873 (x為濃度，y為峰面積)r=0.9994。綠原酸在0.5～105 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好，結(jié)果見表2。

表2 綠原酸含量線性關系

2.5 精密度試驗 精密吸取綠原酸對照品溶液(濃度為21.10 μg/mL)10 μL，注入高效液相色譜儀, 按“2.1” 項下色譜條件連續(xù)進樣6次, 記錄綠原酸圖譜, 綠原酸平均峰面積值為655031，RSD為0.3%。表明方法的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液，過濾后室溫放置，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后按2.1中的色譜條件進行測定，試驗結(jié)果見表3，放置不同時間的峰面積RSD為0.2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 不同時間測定樣品中綠原酸的峰面積

2.7 重復性試驗 稱取同一供試品6份，分別照2.2.2處理并測定綠原酸含量，6份供試品綠原酸平均含量為0.1772%，RSD為0.6%，表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取已測定含量(含量0.1772%) 的同一供試品6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別置6個具塞錐形瓶中，各精密加入濃度為180.0 μg/mL的綠原酸對照品溶液各2.50 mL及50%甲醇溶液47.5 mL，按2.2.2中供試品處理方法進行處理并測定含量，結(jié)果見表4，綠原酸的平均回收率(n=6)為99.2%，RSD=0.5%，表明該方法回收率良好。

表4 綠原酸加樣回收試驗結(jié)果

3 樣品含量測定

取9批材大菟絲子，分別按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1方法測定綠原酸含量(以干基計)。結(jié)果見表5。

表5 樣品中綠原酸含量測定結(jié)果

4 討論

選用甲醇和水溶混合溶劑劑提取，分別考察15 min、30 min、45 min不同超聲提取時間對提取效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取30min，綠原酸已經(jīng)基本提取完全；在提取過程中，改變甲醇-水比例(25%、50%、75%)進行提取溶劑比例的考察，發(fā)現(xiàn)以50%甲醇的提取效果較為理想。

通過對9個不同產(chǎn)地大菟絲子中綠原酸含量測定發(fā)現(xiàn)：綠原酸含量最高的為0.7789%(7號樣，河南)，含量最低的為0.1786%(4號樣，云南)，不同產(chǎn)地的大菟絲子中綠原酸的含量差異明顯，相差4倍多，制定相應質(zhì)量指標限度時需要進一步考察多產(chǎn)地藥材數(shù)據(jù)結(jié)果。中藥材中綠原酸含量測定方法中多以磷酸調(diào)節(jié)流動相酸度[7]，在方法制定及9批大菟絲子中綠原酸含量測定實驗過程中發(fā)現(xiàn)，使用磷酸調(diào)節(jié)流動相酸度時，濃度不宜過高，流動相pH值過低容易造成色譜柱固定相的水解流失，引起柱效下降甚至損壞[8]，在滿足要求的前提下盡量降低使用濃度，因此，本方法流動相采用的磷酸溶液濃度為0.05%，其pH值為2.2，滿足實驗要求的同時也不會對色譜柱造成損壞。

綜上結(jié)果表明本法可靠，準確度高、重復性好，對色譜柱破壞小，可作為大菟絲子中綠原酸含量的分析方法，同時9批大兔絲子中綠原酸含量的測定結(jié)果也為相應標準中指標成分的限度制定提供參考數(shù)據(jù)。