宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000

小半夏湯出自《金匱要略·嘔吐噦下利病脈證治》第12條“諸嘔吐，谷不得下者，小半夏湯主之”[1]。全方由半夏和生姜兩味藥組成。半夏溫燥，功在滌痰化飲，降逆止嘔，為治飲病之要藥；生姜辛散，溫中降逆，消散痰飲[2]。兩藥互相配伍，為后世“見(jiàn)嘔止嘔”治療嘔吐的祖方[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明半夏具有鎮(zhèn)吐、抗腫瘤、抗心律失常、抗炎、降血脂、鎮(zhèn)咳及糖皮質(zhì)激素樣作用[3-4]。生姜主要含有揮發(fā)油、姜辣素和二苯基庚烷3大類(lèi)成分，具有抗氧化、改善脂質(zhì)代謝、降血脂、改善心腦血管系統(tǒng)功能、抗炎、抗腫瘤、降血糖等作用[5]。小半夏湯整方除止嘔外，還能抗炎[6]、治療眩暈[2]等，但其藥效物質(zhì)及作用機(jī)制尚不清楚。

中藥復(fù)方是通過(guò)多成分協(xié)同作用于不同器官的多種靶標(biāo)，調(diào)節(jié)機(jī)體多種生物過(guò)程和功能，進(jìn)而發(fā)揮整體治療作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究契合了這一復(fù)雜體系作用特點(diǎn)，為研究復(fù)方藥效物質(zhì)及作用機(jī)制提供了新思路與方法[7]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)小半夏湯活性成分及靶點(diǎn)、分析其生物功能及信號(hào)通路，旨在探索該方藥效物質(zhì)及作用機(jī)制，為臨床運(yùn)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 分析平臺(tái)與軟件 ① 中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析平臺(tái)BATMAN-TCM(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php/Home/Index/index)；② 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)；③ 蛋白質(zhì)相互作用分析平臺(tái)STRING(https://string-db.org/)；④ 人類(lèi)基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)；⑤ 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot(http://www.uniprot.org/)；⑥ 網(wǎng)絡(luò)圖形拓?fù)浞治雠c編輯軟件Cytoscape ⑦ Omicshare (http://www.omics-hare．com /tools /index.php/)平臺(tái)；⑧ ClueGO基因分析軟件。

1.2 小半夏湯活性成分、靶點(diǎn)篩選及其網(wǎng)狀圖 以口服生物利用度(OB)>30%，類(lèi)藥性(DL)>0.18作為條件，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選小半夏湯中半夏與生姜的活性成分及其靶點(diǎn)；在“藥物-靶點(diǎn)相似性”平臺(tái)BATMAN -TCM中，以相似性模型閥值“Score cutoff=30”為條件篩選小半夏湯中半夏與生姜的活性成分及其靶點(diǎn)，將二者靶點(diǎn)合并后與活性成分導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“小半夏湯活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)狀圖。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將小半夏湯靶蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，蛋白種類(lèi)設(shè)置為“Homo sapiens”，最低相互作用閥值設(shè)為中等“medium confidence”，其余參數(shù)均保持默認(rèn)，構(gòu)建小半夏湯靶蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI network)。將PPI網(wǎng)絡(luò)以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行可視化處理，并利用“Network Analysis”功能計(jì)算各靶點(diǎn)度值(Degree)與介數(shù)(Betweenness)，明確小半夏湯關(guān)鍵靶基因。

1.4 GO生物過(guò)程和KEGG通路富集 采用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，以P-value<0.05篩選小半夏湯靶點(diǎn)富集的KEGG通路并歸類(lèi)，運(yùn)用Omicshare可視化分析KEGG通路；利用Cytoscape軟件中的“BINGO”插件對(duì)所有靶基因進(jìn)行GO富集，再使用“ClueGO”插件對(duì)關(guān)鍵靶基因行GO富集，設(shè)置參數(shù)：定義來(lái)源為“Homo sapiens”(智人)，P值≤0.05，Interval Min Level=11，Max Level=13。

2 結(jié)果

2.1 小半夏湯活性成分、靶點(diǎn)及其網(wǎng)狀圖 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)及BATMAN -TCM平臺(tái)挖掘到小半夏湯12個(gè)活性成分，參考文獻(xiàn)[8-9]再補(bǔ)充鳥(niǎo)苷、亞油酸、姜酮及β-水芹烯，共納入16個(gè)活性成分進(jìn)行研究(表1)。16個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)209個(gè)靶點(diǎn)，其網(wǎng)狀圖含有225個(gè)節(jié)點(diǎn)，288條邊。7個(gè)菱形節(jié)點(diǎn)代表來(lái)源于生姜活性成分，9個(gè)八邊形節(jié)點(diǎn)代表來(lái)源于半夏的活性成分，209個(gè)倒三角形節(jié)點(diǎn)代表活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)(圖1)。網(wǎng)絡(luò)度值平均為18，介數(shù)平均為0.19，其中麻黃堿、β-谷甾醇、姜烯、姜醇、姜酮、纈氨酸6種化合物的度值與介數(shù)均超過(guò)均值，可能是小半夏湯的主要活性成分。

表1 小半夏湯活性成分

圖1 梔子干姜湯活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析 如圖2所示，PPI網(wǎng)絡(luò)有201個(gè)節(jié)點(diǎn)(8個(gè)靶點(diǎn)未參與互作)，1294條作用連線，平均度值為13，平均介數(shù)為0.008。SRC、MAPK1、FOS、JUN、CREB1、ESR1、BCL2、TNF、PIK3CG TH 等43個(gè)靶點(diǎn)的度值、介數(shù)均超過(guò)平均值，說(shuō)明這些靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中處于重要位置，可能是小半夏湯發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3 KEGG信號(hào)通路分析 表2是小半夏湯靶基因參與的7大類(lèi)30條通路，包括6條癌癥通路、4條代謝通路、4條炎癥通路、6條神經(jīng)系統(tǒng)通路、3條心血管系統(tǒng)通路、2條呼吸系統(tǒng)通路及5條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。圖3是所有通路的Omicshare點(diǎn)狀圖分析，由圖可見(jiàn)P值最小的是神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路；富集因子最高的是酪氨酸代謝；而目標(biāo)基因最多的是神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路和癌癥通路。

表2 KEGG信號(hào)通路

續(xù)表2 表2 KEGG信號(hào)通路

圖3 KEGG信號(hào)通路富集

2.4 GO富集分析 利用“BiNGO”插件對(duì)209個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物過(guò)程富集，最終得到P值<0.05的GO條目1915個(gè)，3435個(gè)層級(jí)連線；再通過(guò)ClueGO對(duì)小半夏湯中43個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析得出12大類(lèi)生物過(guò)程(圖4、圖5)，其中4類(lèi)富集于神經(jīng)系統(tǒng)方面，如興奮性突觸后電位的正調(diào)節(jié)(14.29%)、前腦神經(jīng)元發(fā)育(2.04%)、神經(jīng)元投影再生(4.08%)、軸突再生(4.08%)，提示小半夏湯參與的體內(nèi)生物過(guò)程廣泛，尤其在神經(jīng)系統(tǒng)方面更甚。

圖4 GO功能注釋餅狀圖

圖5 GO功能注釋網(wǎng)絡(luò)

3 討論

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)的作用特點(diǎn)，小半夏湯功效研究目前主要局限在止嘔[10]、防眩暈[2]兩方面，其他藥理學(xué)作用及機(jī)制尚不清楚，臨床應(yīng)用范圍狹窄。本研究篩選小半夏湯中16個(gè)活性成分及其209個(gè)靶點(diǎn)，并進(jìn)行KEGG信號(hào)通路和GO生物過(guò)程富集，發(fā)現(xiàn)小半夏湯在炎癥、癌癥、神經(jīng)以及心血管系統(tǒng)等多個(gè)方面都具有藥理作用。

3.1 小半夏湯在心血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面功效研究 從小半夏湯活性成分層面來(lái)看，其在心血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面可能存在良好的治療價(jià)值。李斌等[11]發(fā)現(xiàn)半夏中的麻黃堿、膽堿和鳥(niǎo)苷等生物堿具有抗心律失常的作用，β-谷甾醇以及棕櫚酸、亞油酸等脂肪酸類(lèi)可降低血脂。姜程曦等[12]發(fā)現(xiàn)生姜中的6-姜酚可興奮心臟、擴(kuò)張血管、促進(jìn)血液循環(huán)，增加心肌細(xì)胞肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝取從而加強(qiáng)心肌收縮力。由PPI分析可知，其心血管藥理作用與GPER、SCN5A、KCNH2、PIK3CG等基因密切相關(guān)。GPER是G蛋白耦聯(lián)雌激素受體，參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)平衡、血管緊張度、血管系統(tǒng)受體的表達(dá)、血壓及血管細(xì)胞生長(zhǎng)[13]；SCN5A與心房功能有密切關(guān)系[14]；KCNH2則與長(zhǎng)QT 綜合征有關(guān)[15]；PIK3CG是影響冠心病發(fā)生的微效基因[16]，且上述基因主要富集在腎素分泌、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等心血管通路。GO及KEGG富集顯示小半夏湯靶基因在軸突再生、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)元投影再生等多個(gè)神經(jīng)生物過(guò)程顯著富集，參與帕金森病、γ-氨基丁酸能突觸、膽堿能突觸、5羥色胺受體、多巴胺受體信號(hào)通路等。其中5羥色胺受體與多巴胺受體與嘔吐的發(fā)生密切相關(guān)，它們的受體拮抗劑是臨床常用的止嘔藥物，這也可能是小半夏湯止嘔的中樞機(jī)理。另外，研究[17]發(fā)現(xiàn)半夏總生物堿不僅能改善帕金森病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能；還能增加腦內(nèi)γ-氨基丁酸含量及其受體mRNA的表達(dá)，抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，使腦內(nèi)抑制功能增強(qiáng)，具有抗癲癇作用[18]。半夏中的黃芩苷通過(guò)抑制TNF-α的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)和修復(fù)損傷的血腦屏障，對(duì)大鼠缺血性腦損傷具有保護(hù)作用[19]。而生姜中的姜醇、姜烯和β-水芹烯等揮發(fā)油成分能顯著改善缺血再灌注模型小鼠腦組織含水量[20]；姜黃素則通過(guò)增加FOS基因表達(dá)，抑制JUN基因表達(dá)，避免神經(jīng)元的缺血/再灌注損傷[21]，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

3.2 該復(fù)方在癌癥和炎癥兩方面的作用及機(jī)制探討 KEGG通路分析顯示小半夏湯靶基因顯著富集在癌癥和炎癥上，前者包括前列腺癌、結(jié)直腸癌、小細(xì)胞肺癌、p53信號(hào)通路等多條癌癥通路，涉及PTEN、MAPK1、BCL2、ATF2、MAOA、TGFB1、WNT5A、CASP3和JUN等關(guān)鍵靶基因；后者參與了腫瘤壞死因子、炎性腸病、NF-kB等多條經(jīng)典炎癥通路。研究發(fā)現(xiàn)生姜中的6-姜酚能抑制VEGF誘導(dǎo)的上皮血管細(xì)胞增殖[22]；6-姜烯酚能通過(guò)激活BCL2的表達(dá)，誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡[23]。半夏中的黃芩苷、茴香腦、亞油酸、棕櫚酸、β-谷甾醇、生物堿類(lèi)都具有抗癌作用，如半夏生物堿對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402有明顯的抑制作用[24]，β-谷甾醇可加速乳腺癌細(xì)胞凋亡[25]。炎癥方面，半夏總生物堿對(duì)小鼠急性炎癥有抑制作用，對(duì)大鼠棉球肉芽腫亞急性炎癥也具有較強(qiáng)的抑制作用[26]；生姜中的姜醇、姜烯、β-水芹烯和姜辣素等能明顯降低小鼠毛細(xì)血管通透性，抑制二甲苯所致的耳廓炎癥，抑制肉芽組織增生[9]，這些研究都表明小半夏湯具有一定的抗癌、抗炎潛力。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)小半夏湯能富集在糖尿病、百日咳等疾病，但未見(jiàn)相關(guān)臨床報(bào)道，需進(jìn)一步深入研究。綜上所述，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，小半夏湯多成分-多靶點(diǎn)-多通路-多效應(yīng)的藥理學(xué)作用得以展示，為臨床運(yùn)用拓展奠定了一定的基礎(chǔ)。但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究主要關(guān)注于藥物活性成分，對(duì)其在湯劑中的含量、活性成分間相互作用以及體內(nèi)代謝過(guò)程等考慮不周，故研究結(jié)果尚存在一定的局限性。