李雪斐 魯尚德 陳 銘 錢海兵

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025

心肌缺血(Myocardial ischemia MI)是指由于心臟血液灌注減少，導(dǎo)致心肌供氧減少、心肌能量代謝紊亂，心臟不能正常工作的的一種病理狀態(tài)，是多種心臟疾病的最初階段[1]。血壓降低，主動(dòng)脈供血減少，冠狀動(dòng)脈阻塞，血液黏度的改變，心瓣膜病等都可以導(dǎo)致心肌缺血，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是造成心肌缺血的主要原因之一，研究還發(fā)現(xiàn)治療血脂與炎癥，改善動(dòng)脈粥樣硬化可減少心肌缺血的發(fā)生[2]。

根據(jù)心肌缺血引起的臨床表現(xiàn)，在中醫(yī)理論體系中可歸屬于“胸痹”“心悸”范疇，其病位在心，可累及脾肺肝腎諸臟。中醫(yī)普遍認(rèn)為，該病癥是由于氣血陰陽平衡失調(diào)所導(dǎo)致，而氣血陰陽多由虛所致，虛又是缺血，缺氧之根本，所以病理狀態(tài)以虛實(shí)夾雜，本虛標(biāo)實(shí)多見[3]。隨著對(duì)“胸痹”“心悸”的歷史認(rèn)識(shí)逐漸加深，以及對(duì)古代醫(yī)家療法的繼承以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，關(guān)于各種治療“胸痹”“心悸”的中藥復(fù)方和中藥單分子機(jī)制方面研究越來越多。有實(shí)驗(yàn)證明由異丙腎上腺素所引起的心肌缺血，通過灌服辛溫通陽中藥，減輕大鼠心肌缺血的癥狀，其機(jī)制與血清中相關(guān)的炎性因子有關(guān)。從大量實(shí)驗(yàn)及臨床觀察可以得知[4]，通過研究中藥對(duì)心肌缺血分子機(jī)理的各種調(diào)節(jié)、影響，可能找到治療心肌缺血的新方向，為臨床治療心肌缺血提供新思路、新方法。

苗藥鐵筷子(HelleborusthibetnusFranch.)為臘梅科臘梅屬(Chimonanthus)植物臘梅(ChimonanthuspraecoxL.link.)及山臘梅(Chimonanthus nitens Oliv.)的干燥根，味辛性溫，藥理研究表明，具有鎮(zhèn)痛、理氣、活血化瘀的功效[5]，且對(duì)于苗族人民，有長期的使用歷史，前期實(shí)驗(yàn)證明臘梅葉總對(duì)心肌缺血具有保護(hù)作用[6]，但是鐵筷子醇提物對(duì)于治療心肌缺血及保護(hù)心肌的實(shí)驗(yàn)研究國內(nèi)外鮮少見到，因此本實(shí)驗(yàn)以此為依據(jù)模擬現(xiàn)代人高脂高熱量飲食引起的冠心病心肌缺血，從血脂及炎癥方面進(jìn)一步探索苗藥鐵筷子的作用與功效，對(duì)民族醫(yī)藥的開發(fā)和利用具有一定作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重200～220 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，(動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK(湘)2014-0011)。

1.2 藥品與試劑 鐵筷子采自貴陽市烏當(dāng)區(qū)三江鎮(zhèn)農(nóng)場，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室劉曉龍研究員鑒定為臘梅科臘梅屬(Chimonanthus)植物臘梅的根；4%多聚甲醛(北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：0626-A18)；無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)：20180718)；二甲苯(成都高科龍化工試劑廠，批號(hào)：2015072801)；HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20180820)。

1.3 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司R-1010)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(賽默飛世爾公司 1510)；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾公司Thermo ST16R)；熒光定量 PCR 儀(成都百樂科技有限公司 CFX96TM )；石蠟切片機(jī)(德國萊卡公司RM2245)；包埋機(jī)(浙江金華科迪有限公司KD-BM)。

2 方法

2.1 供試品的制備 鐵筷子用體積分?jǐn)?shù)為0.78的乙醇熱回流提取，減壓濃縮，蒸干得浸膏，得膏率約為 13.31%。

2.2 動(dòng)物造模、分組及給藥 36只大鼠除正常組外，其余五組均給予高脂飼料喂養(yǎng)，正常組大鼠用正常飼料喂養(yǎng)(高脂飼料配比為：膽固醇1 %+豬油1 %+蛋黃10 %+丙硫氧嘧啶0.61 %+正常飼料粉78.39 %)，高脂飼料喂養(yǎng)2個(gè)月后灌胃給藥正常組、模型組、陽型組(復(fù)方丹參滴丸灌胃(67.5 mg/kg))、鐵筷子醇提物高(465.5 mg/ kg)、中(232.925 mg/ kg)、低劑量組(119.615 mg/kg)，高脂飼料喂養(yǎng) 2 個(gè)月后，模型組、陽性組、鐵筷子高劑量組、鐵筷子中劑量組、鐵筷子低劑量組給予腹腔注射維生素 D2(30IU/kg·d)，連續(xù)腹腔注射7 d，正常組給予腹腔注射相同劑量的生理鹽水。高脂飼料喂養(yǎng)6個(gè)月最后7 d，除正常組，其余各組每天給予皮下注射鹽酸異丙腎上腺素(5 mg/kg·d)，正常組給予腹腔注射相同劑量的生理鹽水，連續(xù)腹腔注射7 d。

2.3 檢測

2.3.1 病理學(xué)檢測主動(dòng)脈及心肌HE染色并對(duì)病理損傷評(píng)分 動(dòng)脈粥樣硬化造模完成后隨機(jī)取正常組與模型組進(jìn)行動(dòng)脈血管壁檢測，最后取材時(shí)在腹主動(dòng)脈取血后，大鼠還有呼吸的狀態(tài)下，進(jìn)行心臟的摘取、去毛、腹部及胸部皮膚消毒，沿腹部正中線剪開腹部和胸部皮膚，鈍性剝開皮膚及皮下組織，用眼科剪剪開心包膜，暴露心臟，取下心臟組織，用生理鹽水清洗心臟上的血液，將心臟放入裝有 4%多聚甲醛的 EP 管中。

2.3.2 心電圖檢測 用4%的水合氯醛腹腔注射麻醉(0.75 mL/100g)，將麻醉后的大鼠仰臥位固定于木板上，并在大鼠四肢內(nèi)側(cè)皮下平刺插入針灸針，將電極連接在針灸針上，避免其他干擾因素(保證室內(nèi)處于無風(fēng)的環(huán)境)，在系統(tǒng)中選擇“循環(huán)系統(tǒng)，II導(dǎo)聯(lián)”，記錄并觀察好心電圖的變化。

2.3.3 血清血脂四項(xiàng)檢測 腹主動(dòng)脈取血，室溫下靜置30 min后，離心機(jī)4000 rpm，15 min離心取上清，分別分裝于編號(hào)不同的 EP 管中，進(jìn)行血脂四項(xiàng)檢測。

2.3.4 血清心肌酶及細(xì)胞因子檢測 Elisa試劑盒檢測大鼠血清CK-MM，CK-MB，TNF-α、IL-6、IL-18其步驟按照Elisa試劑盒說明書進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 主動(dòng)脈病理學(xué)檢查 動(dòng)脈粥樣硬化模型復(fù)制完成后，采用隨機(jī)原則，從正常組及模型組中選取大鼠 HE 染色(80倍)進(jìn)行主動(dòng)脈的觀察，與正常組相比模型組都有不同程度的脂質(zhì)沉積、動(dòng)脈壁增厚及斑塊出現(xiàn)，可以認(rèn)定為動(dòng)脈粥樣硬化造模成功。如圖1所示。

A B

3.2 心電圖檢測 實(shí)驗(yàn)最后1天，大鼠皮下注射異丙腎上腺素 30min，在麻醉狀態(tài)下對(duì)大鼠進(jìn)行心電圖檢測從心電圖(如圖2所示)中可以看出，與正常組相比，模型組出現(xiàn)不同程度的 ST 段的改變(ST>0.05 mV)(見表1)，可以認(rèn)定心肌缺血造模成功。

組別nST/mV正常組60.022±0.004模型組60.238±0.047a陽性組60.080±0.006b高劑量組60.073±0.011b中劑量組60.244±0.081a低劑量組60.615±0.113ab

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

3.3 鐵筷子醇提物對(duì)心肌缺血病理損傷的影響 觀察心肌細(xì)胞變性、間質(zhì)水腫、纖維組織增生、血管反應(yīng)、炎癥細(xì)胞浸潤、出血。上述病變占組織塊的 30 %以下+(1分)，占 30 %～50 %++(2分)，占 50 %以上+++(3分)，將所有評(píng)分累加即心肌細(xì)胞損傷的評(píng)分，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為0分為0級(jí)，1～3分為1級(jí)，4～7分為2級(jí)，≥8分為3級(jí)。評(píng)分結(jié)果顯示空白組和陽性組 SD 大鼠心肌細(xì)胞損傷程度明顯輕于其他各組，各組間比較有差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組與鐵筷子醇提物高、中劑量組比較，心肌細(xì)胞損傷明顯(P<0.05)，但與鐵筷子醇提物低劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；陽性組與鐵筷子醇提物低、中劑量組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與鐵筷子醇提物高劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3和表2。

A組:正常組；B組:模型組；C組:復(fù)方丹參滴丸組；D組:高劑量組；E組:中劑量組；F組:低劑量組。圖3 心臟組織HE染色(X200)

表2 各組SD大鼠心肌細(xì)胞損傷評(píng)分比較 (分，

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

3.4 鐵筷子醇提物對(duì)心肌缺血模型血清血脂四項(xiàng)的影響 6組TG、CHOL、HDL-C、LDL-L各項(xiàng)表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組與正常組、陽性組、高劑量組、中劑量組、低劑量組比較，血脂四項(xiàng)的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可以認(rèn)定高脂血癥造模成功。與正常組相比，給藥組與陽性組的低密度脂蛋白偏高，高密度脂蛋白偏低，與模型組比，陽性組與給藥組低密度脂蛋白要低，高密度脂蛋白要高，說明有一定的治療效果，能降低血脂，但是效果不明顯，仍存在血管病變的危險(xiǎn)。見表3。

組別nTGTCHDL-CLDL-C正常組60.517±0.2320.962±0.1113.850±0.3950.263±0.689模型組67.108±2.110a10.277±1.032a0.803±0.805a2.432±0.747a陽性組62.343±0.227ab1.641±0.289ab1.787±1.596ab0.780±0.521ab高劑量組60.990±0.506b1.642±0.289ab3.851±0.458b0.388±0.131ab中劑量組61.730±0.716ab2.587±0.261ab2.072±0.952ab1.455±0.333ab低劑量組62.677±0.103ab3.582±0.239ab1.585±0.195ab1.623±0.774ab

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

3.5 鐵筷子醇提物對(duì)大鼠血清心肌酶及細(xì)胞因子的影響 模型組與空白組、陽性組、高劑量組、中劑量組、低劑量組比較，血清心肌酶及各炎癥因子的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可以認(rèn)定高脂血癥造模成功；與模型組比，陽性組，鐵筷子醇提物高、中、低劑量組均血清CK-MM，CK-MB TNF-α、IL-6、IL-18明顯降低(P<0.05)提示鐵筷子醇提物具有心肌保護(hù)作用。見表4、表5。

組別nCK-MM/uU/mLCK-MB/ng/mL正常組659.883±6.826 7.700±0.811模型組6154.748±17.647a17.671±2.825a陽性組699.167±6.249ab11.405±0.903ab高劑量組663.410±14.002b8.693±2.394b中劑量組6 79.590±29.926ab12.284±1.658ab低劑量組693.253±7.977ab12.810±1.640ab

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

組別nIL-6/pg/mLIL-18/ngl/mLTNF-α/ng/mL正常組613.040±1.0726.481±0.81410.350±1.511模型組632.127±2.802a13.107±2.779a29.742±3.117a陽性組625.915±5.387ab9.188±0.908ab20.807±2.992ab高劑量組617.026±3.090ab6.455±2.391b15.970±3.866ab中劑量組623.277±2.362ab10.063±1.659ab18.167±3.100ab低劑量組625.388±3.737ab11.988±1.674a22.278±2.825ab

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

4 討論

本次實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射維生素 D2 的目的是造成血管 Ca2+的增加，從而造成血管內(nèi)皮的損傷。研究表明，醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為高脂血癥是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化一系列心血管疾病的“罪魁禍?zhǔn)住保獫{中所含有的脂質(zhì)包括膽固醇、甘油三酯等，在正常范圍內(nèi)，這些脂類是人體所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，如果血脂過多，超過正常范圍，就能形成脂質(zhì)代謝紊亂，血液的黏稠度增高，血流速度減慢，脂類代謝物質(zhì)就會(huì)在血管壁內(nèi)沉積，形成小“斑塊”，再加上維生素 D2 的作用，加重的斑塊的形成，逐漸堵塞了血管，使得血管管腔狹窄，血液流動(dòng)不暢。選擇鹽酸異丙腎上腺素作為心肌缺血的造模藥物，鹽酸異丙腎上腺素具有強(qiáng)烈的收縮冠狀動(dòng)脈的作用，同時(shí)能夠增強(qiáng)心肌收縮力并且能夠加快心率，從而增加心肌的耗氧量，加強(qiáng)心肌缺血，持續(xù)的心肌缺血能夠進(jìn)一步的誘發(fā)心肌梗死。所以本實(shí)驗(yàn)通過3種造模方式聯(lián)合模擬心肌缺血而導(dǎo)致的慢性心臟疾病，以便更能貼近臨床。動(dòng)脈粥樣硬化造模完成后隨機(jī)抽取的大鼠主動(dòng)脈病理切片結(jié)果與心電圖結(jié)果證明本次實(shí)驗(yàn)造模成功。

血脂異常是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素，血漿中脂質(zhì)在血管壁上的沉積也是發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化的必要前提條件。LDL-C 是指血漿中低密度脂蛋白所含的膽固醇，是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素；HDL-C 具有抗動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的作用，是減少冠心病發(fā)生，發(fā)展的獨(dú)立因素，HDL 能夠抑制血小板凝聚，促進(jìn)纖維蛋白溶解的作用，有利于微小血栓的形成，并且可以通過多種方式起到抗血栓作用。甘油三酯(TG)也是血漿中的重要成分，所代謝的極低密度脂蛋白(VLDL)能夠被巨噬細(xì)胞攝入進(jìn)入動(dòng)脈壁，產(chǎn)生直 AS 作用，同時(shí)還能促進(jìn)血栓形成，引起血液的高凝狀態(tài)，從而增加危險(xiǎn)度[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高脂飼料喂養(yǎng)大鼠，模型組大鼠的 TC、TG、LDL-C 明顯升高，HDL-C下降，說明長期的高脂飲食，可以造成血脂的改變。與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與模型組比較，各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)都有一定程度的下降，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，由結(jié)果可見，鐵筷子醇提物在一定程度上可以起到調(diào)節(jié)血脂的作用，同時(shí)可以通過降低 TG，提高 HDL-C，降低 LDL-C，阻止其氧化，抑制炎癥細(xì)胞的浸潤以及血管內(nèi)血栓的形成，到達(dá)抗 AS 的作用，有效的防止高脂血癥這個(gè)早期高危因素的形成，從而進(jìn)一步防止心肌缺血的形成。

腫瘤壞死標(biāo)志物(TNF)是一種可以直接造成腫瘤細(xì)胞死亡的細(xì)胞因子，在心血管疾病中起主要作用的是TNF-α[8]，同時(shí)，TNF能夠直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其血管的通透性增高，血液中的膽固醇能夠很容易的通過血管內(nèi)膜，而造成膽固醇的沉積，從而形成斑塊。而且細(xì)胞受損，內(nèi)膜的增厚，也能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成，進(jìn)而加重心肌缺血，因此，TNF 被認(rèn)為是冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能紊亂以及內(nèi)膜增厚的主要原因[9]。IL-6又被稱為前炎癥細(xì)胞因子，在細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中與AS形成的早期階段有著重要作用[10]，IL-6能夠侵蝕斑塊內(nèi)部的基質(zhì)，能造成斑塊的破裂，并且血清中 IL-6濃度越高，發(fā)生心肌缺血以及心絞痛的風(fēng)險(xiǎn)也就越高，是健康人將來發(fā)生心肌梗塞的危險(xiǎn)性的預(yù)測因子。無論是心肌缺血還是心肌梗塞等其他心血管疾病，IL-6的水平都是升高，進(jìn)一步說明 IL-6與心血管疾病密切相關(guān)[11]。IL-18是炎癥反應(yīng)中重要的調(diào)節(jié)因子，并且是炎癥疾病的重要介質(zhì)，在炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，血清中 IL-18水平的升高，能夠引起動(dòng)脈斑塊的不穩(wěn)定性。并且有相關(guān)研究證實(shí)，血清 IL-18水平的升高，甚至有可能導(dǎo)致斑塊的破裂，說明 IL-18或許可以對(duì)冠心病患者的發(fā)生及發(fā)展存在的因果關(guān)系[12]。

CK-MM、CK-MB 都是評(píng)價(jià)心肌缺血損傷程度的重要指標(biāo)。CK-MB、CK-MM 主要分布于骨骼肌和心肌中，在各種酶中是最早進(jìn)入血液中的，其分子量小，所以分布量廣，數(shù)量多，所以是心肌缺血時(shí)血清酶最早升高的一類。有文獻(xiàn)表明，當(dāng)患者發(fā)生急性心肌梗死時(shí)，CK-MM、CK-MB 都會(huì)超過正常水平，異常升高，尤其是 CK-MB。心肌梗死時(shí) CK-MB 保持著高水平，有文獻(xiàn)指出，心絞痛時(shí)血清中 CK-MB 也會(huì)表現(xiàn)出高水平，因此將 CK-MM、CK-MB 視為診斷急性心肌梗死的“金標(biāo)準(zhǔn)”[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組與正常組相比，模型組血清TNF-α、IL-6、IL-18 顯著升高，鐵筷子醇提物高、中、低劑量組與模型組比較，鐵筷子高劑量組血清 TNF-α 水平明顯降低(P<0.05)，中劑量與低劑量血清 TNF-α 水平有下降，其中低劑量下降差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明鐵筷子醇提物能夠降低血清 TNF-α 的水平，能夠抑制炎性因子的表達(dá)，起到抗炎作用，對(duì)心肌缺血具有一定的保護(hù)作用，其中高劑量效果最為明顯。模型組中心肌酶 CK-MM、CK-MB、LDH 三項(xiàng)指標(biāo)與正常組比顯著升高(P<0.05)，說明 ISO 可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷，提示心肌缺血模型制備可靠。鐵筷子醇提物高、中、低劑量組中 CK-MM，CK-MB 指標(biāo)均低于模型組(P<0.05)，證明一定劑量的鐵筷子醇提物能夠?qū)π募∑鸬奖Ｗo(hù)作用。