張曉東，李雅舒，陳 金，莫 莉，包玉英

(1.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010071; 2.內(nèi)蒙古大學(xué) 省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010071; 3.內(nèi)蒙古大學(xué) 牧草與特色作物生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010071; 4.內(nèi)蒙古大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

近幾十年以來，我國露天煤礦發(fā)展迅速，占全國煤炭產(chǎn)量的比重逐漸增加，主要分布在山西以及內(nèi)蒙古草原地區(qū)，露天煤礦正在向高度集中化、集約化方向發(fā)展[1]。由于煤炭露天開采導(dǎo)致地表剝離嚴(yán)重、地下水位下降[2]、產(chǎn)生大量粉塵及有害氣體[3]，嚴(yán)重影響地下水、大氣、動植物的多樣性及穩(wěn)定性，加速草原地區(qū)的鹽堿化和沙漠化，進(jìn)而影響居民健康生活和正常活動。

重金屬通常情況下主要以穩(wěn)定的狀態(tài)存在于生態(tài)環(huán)境中，但是由于礦山開采，金屬冶煉，存在于土壤中的重金屬被剝離到地表，隨著大氣、水流進(jìn)入到土壤及水環(huán)境中[4-6]，礦區(qū)附近的重金屬污染非常嚴(yán)重，已經(jīng)嚴(yán)重危害到附近居民飲食和生活健康，是我國面臨重金屬污染治理的巨大挑戰(zhàn)和難題。

目前對露天煤礦環(huán)境治理及生態(tài)修復(fù)的研究多集中于不同復(fù)墾模式的修復(fù)效應(yīng)[7]和排土場綠化[8]，對微生物修復(fù)少有報(bào)道。趙旭鵬等[9]對礦區(qū)土壤微生物多樣性的研究顯示，開采早期區(qū)域的生物多樣性較開采晚期區(qū)域的低，可見露天開采影響土壤微生物的多樣性。在重金屬的脅迫下[10-14]，耐受力弱的微生物會迅速減少或滅亡。耐受力強(qiáng)的微生物可以正常存活，微生物不會降解重金屬，但是可以富集[15-18]或轉(zhuǎn)移重金屬，達(dá)到改良土壤的目的。CHON等[19]研究發(fā)現(xiàn)微生物在自然條件下，通過提供適當(dāng)?shù)奶荚?，在土壤水或地下水運(yùn)輸?shù)倪^程中，會在固體表面形成生物膜可以有效地吸附重金屬，特別是帶正電荷的重金屬;對于砷等氧化還原敏感的元素，微生物還原三價(jià)鐵或硫酸鹽以及硫化物形成的沉淀可大大降低有毒元素的遷移率。研究表明，植物和微生物均對重金屬具有富集或遷移作用。

耐重金屬細(xì)菌由于對重金屬具有交叉抗性[20]，以及對重金屬有不同的耐受程度，需要對細(xì)菌進(jìn)行整體的篩選以及嘗試不同重金屬濃度梯度的檢測，以確保數(shù)據(jù)的真實(shí)性和準(zhǔn)確性。

本研究以寶日希勒露天煤礦區(qū)土壤為研究對象，采用高溫高壓滅菌法和過膜除菌方法相結(jié)合的方法，確保重金屬溶液結(jié)構(gòu)不被破壞的前提下，在前人研究[21-24]的基礎(chǔ)上利用二價(jià)鐵、二價(jià)錳、二價(jià)銅、六價(jià)鉻對細(xì)菌進(jìn)行分離，最終篩選出優(yōu)良耐重金屬細(xì)菌，并對細(xì)菌進(jìn)行耐受力檢測以及鑒定，對優(yōu)良菌株進(jìn)行保藏，為礦區(qū)未來的土地復(fù)墾和生態(tài)修復(fù)提供重要的理論依據(jù)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

寶日希勒露天礦地處呼倫貝爾草原中部，距離呼倫貝爾市中心海拉爾區(qū)15 km。礦區(qū)坐標(biāo)為東經(jīng)119.399°～119.606°，北緯49.323°～49.425°。該地區(qū)屬于亞寒帶大陸性半干旱氣候區(qū)，年平均氣溫在-2.6 ℃，年最低溫度-48 ℃，年最高溫度37.7 ℃，冬季寒冷漫長，夏季涼爽干旱[25]。

1.2 樣地選擇及樣品采集

選取寶日希勒露天礦外草原區(qū)為樣區(qū)，設(shè)置采樣點(diǎn)。寶日希勒露天礦的開采推進(jìn)方向?yàn)橛晌飨驏|，隨著采挖擴(kuò)大和推進(jìn)，礦坑和排土場面積逐漸擴(kuò)大。礦坑南面受其他因素(道路交通等)干擾嚴(yán)重，而礦坑北面為自然放牧地，受其他因素的擾動較少。因此，本研究選擇礦坑北面作為研究區(qū)，距離礦坑外圍300 m的位置取1條線，從西向東分別設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn):A(礦坑最西側(cè)，最先開采)，B，C(目前正在開采)。同時(shí)取2處參照區(qū)，1處為距離露天礦20 km的陳巴爾虎旗檢測場(國家級草原固定檢測點(diǎn))，此處是天然草原群落，不受人為和生產(chǎn)活動的干擾，記為W。另1處采樣點(diǎn)位于礦區(qū)內(nèi)尚未復(fù)墾的排土場，記為K。

在A，B，C，W，K五個(gè)樣地，每個(gè)樣地分別取3個(gè)1 m×1 m的樣方，取0～10 cm土壤各2 kg置于無菌塑封袋中，將每個(gè)樣地的3份土壤進(jìn)行混勻，土樣在實(shí)驗(yàn)室條件下過篩(2 mm)處理，放于4 ℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 篩選方法

將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，冷卻至60 ℃，加入過膜除菌后的重金屬溶液，倒入平板凝固，制成200 mg/L的Cu2+,Fe2+,Mn2+,Cr6+離子質(zhì)量濃度為200 mg/L的重金屬培養(yǎng)基，將懸菌液進(jìn)行涂板，24 h后觀察。

挑取重金屬培養(yǎng)基上的單菌落，置于重金屬質(zhì)量濃度為400 mg/L的培養(yǎng)基中，24 h后觀察，以此類推，直到每種重金屬培養(yǎng)基只長出1種菌落為止，即為最高耐受菌株。

1.4 菌株生理生化能力檢測

將篩選出的菌株進(jìn)行碳源利用實(shí)驗(yàn)、氮源利用試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、酪氨酸水解試驗(yàn)、酪蛋白水解試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)。

將篩選出對4種重金屬耐受力最強(qiáng)的細(xì)菌進(jìn)行生長曲線的測定，配置質(zhì)量濃度為0，100，200，300 mg/L的重金屬液體培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置12個(gè)重復(fù)，將提前搖好的細(xì)菌懸濁液取100 μL進(jìn)行接種，分別在0，2,4，6，8，10，12，14，16，18，20 h取樣測OD值(600 nm波長)，繪制細(xì)菌的生長曲線。

1.5 菌株的鑒定

菌株采用16s rDNA分子生物學(xué)鑒定:挑取單菌落于1.5 mL離心管中，加入細(xì)菌通用引物27F(5′—AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG—3′)1 μL，1492R(5′—TACGG CTACC TTACG ACTT—3′)1 μL，加入25 μL 2xTaq PCR Master Mix，23 μL DDH2O，構(gòu)建50 μL的PCR反應(yīng)體系，反映條件為高溫預(yù)變性94 ℃，10 min，變性94 ℃、30 s，退火55 ℃、40 s，延伸72 ℃、1 min，35次循環(huán)，后延伸72 ℃、3 min，最后4 ℃永久恒溫。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，20 min后進(jìn)行凝膠成像分析，觀察到條帶后將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測序。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和初步分析;采用IBM SPSS Statistics 20軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，再采用字母標(biāo)記法，根據(jù) Duncan 多重比較法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異度標(biāo)記;采用graphpad prism8軟件進(jìn)行圖形的制作與處理(所有圖片中的誤差線均為重復(fù)之間的最高值和最低值);采用MEGA7進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選結(jié)果

土壤耐重金屬銅、鐵、錳、鉻的細(xì)菌共篩到16株(表1)，其中耐重金屬銅共篩到3株，耐重金屬鐵共篩到3株，耐重金屬錳共篩到9株，耐重金屬鉻共篩到1株。其中3株耐重金屬銅的細(xì)菌中，有1株的最高耐重金屬的質(zhì)量濃度達(dá)到500 mg/L;在3株耐重金屬鐵的細(xì)菌中，有1株的最高耐重金屬質(zhì)量濃度達(dá)到500 mg/L;在1株耐重金屬鉻的細(xì)菌的最高耐重金屬質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L。在9株耐重金屬錳的細(xì)菌中，其中1株的耐重金屬質(zhì)量濃度達(dá)到50 g/L，由于重金屬質(zhì)量濃度已到達(dá)過膜除菌方法的最大溶解度，這株菌在更高濃度中可能會生長，可能為1種新型的耐重金屬錳的菌株。

表1 細(xì)菌生理生化反應(yīng)
Table 1 Physiological and biochemical reactions of bacteria

生理生化反應(yīng)XCu-1XFe-1XMn-1XCr-1蔗糖碳源+---淀粉碳源++++甘油碳源+---葡萄糖碳源++++(NH4)2SO4氮源+-++KNO3氮源+---淀粉水解試驗(yàn)++++酪蛋白水解試驗(yàn)++++酪氨酸水解試驗(yàn)----V-P試驗(yàn)++++D-葡萄糖產(chǎn)酸試驗(yàn)++++D-葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)----D-木糖產(chǎn)酸試驗(yàn)----D-甘露糖產(chǎn)酸試驗(yàn)++++L-阿拉伯糖產(chǎn)酸試驗(yàn)----

注:“+”表示陽性，“-”表示陰性。

2.2 菌株生理生化能力檢測

4種耐受菌株對不同碳源利用、不同氮源利用、淀粉水解、酪氨酸水解、酪蛋白水解、V-P試驗(yàn)、糖發(fā)酵特性試驗(yàn)結(jié)果見表1。

耐重金屬鐵菌株XFe-1生長曲線如圖1所示。在前10 h的培養(yǎng)中細(xì)菌處于延緩期，10～16 h處于對數(shù)期，16 h后到達(dá)穩(wěn)定期。0 mg/L的細(xì)菌生長曲線的斜率大于100，200，300 mg/L的細(xì)菌生長曲線，說明重金屬Fe2+的加入會抑制細(xì)菌的生長，隨著Fe2+質(zhì)量濃度的增大，細(xì)菌的受抑制會更明顯。并且重金屬Fe2+增加到200 mg/L以上時(shí)，細(xì)菌的受抑制作用相當(dāng)明顯，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到300 mg/L時(shí)，可以看到細(xì)菌的質(zhì)量濃度達(dá)不到未污染培養(yǎng)基的一半，可見重金屬Fe2+質(zhì)量濃度對細(xì)菌的毒性呈對數(shù)增長。

圖1 耐重金屬鐵質(zhì)量濃度梯度細(xì)菌生長曲線Fig.1 Fe2+concentration gradient growth curves

耐重金屬銅菌株XCu-1生長曲線如圖2所示。在重金屬Cu2+的脅迫作用下，0～4 h細(xì)菌處于延緩期，細(xì)菌狀態(tài)比較穩(wěn)定，在4～16 h，細(xì)菌的數(shù)量成倍的增加，細(xì)菌處于對數(shù)期，在16 h之后，細(xì)菌的數(shù)量達(dá)到峰值，并且會逐漸減少。由圖2可見，當(dāng)重金屬Cu2+的質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)，細(xì)菌的質(zhì)量濃度比0 mg/L的細(xì)菌質(zhì)量濃度高，并且當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L的時(shí)候，細(xì)菌的質(zhì)量濃度甚至比100 mg/L的質(zhì)量濃度還要高，但是當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度達(dá)到300 mg/L時(shí)細(xì)菌的質(zhì)量濃度會比之前3個(gè)污染梯度低，因此可以斷定，重金屬Cu2+質(zhì)量濃度在200 mg/L以內(nèi)時(shí)，重金屬Cu2+對細(xì)菌的生長起促進(jìn)作用，細(xì)菌質(zhì)量濃度與重金屬Cu2+質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，這可能是由于低質(zhì)量濃度銅下，細(xì)菌可以吸附銅離子作為自身的生長因子，但是當(dāng)重金屬Cu2+質(zhì)量濃度高于200 mg/L時(shí)，重金屬的毒性超出了細(xì)菌耐受的毒性，因此細(xì)菌的質(zhì)量濃度會逐漸降低，細(xì)菌質(zhì)量濃度與重金屬Cu2+質(zhì)量濃度成反比。

圖2 耐重金屬銅質(zhì)量濃度梯度細(xì)菌生長曲線Fig.2 Cu2+ concentration gradient growth curves

耐重金屬鉻細(xì)菌XCr-1生長曲線如圖3所示。在前8 h內(nèi)，細(xì)菌處于延緩期，在8～16 h內(nèi)細(xì)菌迅速增長，處于對數(shù)期，在20 h后細(xì)菌數(shù)量基本處于平穩(wěn)狀態(tài)，細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期，隨著重金屬Cr6+質(zhì)量濃度的升高細(xì)菌的生長受到抑制，細(xì)菌可能受重金屬毒性的影響，Cr6+質(zhì)量濃度越大，細(xì)菌的數(shù)量越少，且增長緩慢。

圖3 耐重金屬鉻質(zhì)量濃度梯度細(xì)菌生長曲線Fig.3 Cr6+ concentration gradient growth curves

耐重金屬錳菌株XMn-1的生長曲線如圖4所示。在0～4 h內(nèi)，細(xì)菌的質(zhì)量濃度緩慢升高，細(xì)菌處于延緩期，細(xì)菌在4～16 h細(xì)菌的數(shù)量迅速增多，細(xì)菌處于對數(shù)期，在20 h之后細(xì)菌的數(shù)量會有所下降，細(xì)菌處于衰亡期。在重金屬錳離子的脅迫下，并不是錳離子質(zhì)量濃度越高細(xì)菌生長受到抑制，在100 mg/L的錳離子培養(yǎng)液中，細(xì)菌的生長反而比0 mg/L的細(xì)菌生長狀態(tài)要好，因此可以斷定，當(dāng)Mn2+質(zhì)量濃度為0～100 mg/L時(shí)，細(xì)菌的質(zhì)量濃度會隨著錳離子質(zhì)量濃度的增大而增大，錳離子對細(xì)菌的增殖起到了促進(jìn)作用。當(dāng)Mn2+質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)，細(xì)菌的生長曲線斜率小于0 mg/L的培養(yǎng)液的細(xì)菌，可見重金屬錳離子的質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)，細(xì)菌的生長就會受到抑制，且Mn2+質(zhì)量濃度越大抑制作用越明顯。綜上，該菌株在Mn2+質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)，會促進(jìn)細(xì)菌的增殖，當(dāng)Mn2+質(zhì)量濃度高于200 mg/L時(shí)，會抑制細(xì)菌的增殖。

圖4 耐重金屬錳質(zhì)量濃度梯度細(xì)菌生長曲線Fig.4 Mn2+ concentration gradient growth curves

2.3 菌株的鑒定

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，20 min后進(jìn)行凝膠成像分析(圖5)，擴(kuò)增片段大小約在1 500 bp，條帶清晰。

圖5 細(xì)菌DNA電泳Fig.5 Bacterial DNA electrophoresis

耐重金屬細(xì)菌16s rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的對比序列相似度均在99%以上(除XMn-1菌株以外，相似度僅為85.37%)，序列的分析結(jié)果見表2。4種細(xì)菌分別為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillustoyonensis)，XMn-1與巨大芽孢桿菌基因序列相似度為85.37%，屬芽孢桿菌屬，可能為新種。

表2 耐重金屬細(xì)菌16s rDNA基因序列分析結(jié)果
Table 2 Sequence analysis of heavy metal resistantbacteria 16s rDNA

菌株編號拉丁名中文名GenBank登錄號相似度/%XCu-1Bacillus cereus蠟樣芽胞桿菌EU857430.198.29XFe-1Bacillus toyonensis蠟狀芽孢桿菌KY393017.198.00XCr-1Brevibacterium sp.短桿菌屬M(fèi)G309358.198.95XMn-1Bacillus 芽孢桿菌屬 GU188935.185.37

利用MEGA 7軟件，將4株耐重金屬菌株的16s rDNA基因序列采用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，。選取GenBank對比序列相似度高于98%的兩個(gè)菌株序列，根據(jù)分子生物學(xué)原理，序列相似度高于96%就可以認(rèn)為是同一個(gè)種(圖6)。

圖6 耐重金屬細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic trees of bacteria resistant to heavy metals

耐重金屬細(xì)菌分子鑒定結(jié)果顯示，耐重金屬細(xì)菌XCu-1為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)，劉海燕[26]研究發(fā)現(xiàn)從廢棄重金屬水中分離出的耐重金屬銅細(xì)菌也包括芽孢桿菌，與本研究結(jié)果基本一致，芽孢桿菌具有耐銅特性。董新姣[27]從電鍍廠廢水污泥中分離到一株高耐銅的菌株，它能耐受Cu2+的最高質(zhì)量濃度為560 mg/L,通過形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特性測定，初步鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，由此可知，除芽孢桿菌外，假單胞菌也具有耐銅特性。XCr-1屬于短桿菌屬(Brevibacterium)，此前舒彩云[28]、石青[29]研究發(fā)現(xiàn)短桿菌具有耐鹽、耐寒等特性，關(guān)于耐重金屬性還未有報(bào)道，可見短桿菌屬是一種具有多種抗逆性菌株。XFe-1為蠟狀芽孢桿菌(Bacillustoyonensis)，周明[30]研究發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌為一種石油降解菌，可以有效的降解石油原油。石油中含有大量重金屬，微生物石油污染修復(fù)具有高效、無二次污染和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，受到研究者的高度重視[31]，因此菌株也可用降解石油中的重金屬，石油中含有大量重金屬鐵，蠟狀芽孢桿菌對石油中的重金屬鐵可能具有降解作用，這與本文的研究結(jié)果相似。

XMn-1菌株經(jīng)過NCBI基因序列比對，與最高相似度的巨大芽孢桿菌僅為85.37%，為未知種。

本研究篩選出的細(xì)菌為耐受性細(xì)菌，但是否對重金屬具有富集作用或者遷移作用還未曾考證，有待進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

本研究篩選出4株耐受重金屬鐵、錳、銅、鉻細(xì)菌，對這些來源于礦區(qū)土壤的能在一定的重金屬污染環(huán)境下生存的細(xì)菌菌株，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)并開展應(yīng)用研究，可為改善礦區(qū)土壤重金屬污染提供菌種資源和理論依據(jù)。

3 結(jié) 語

從寶日希勒礦區(qū)土壤中獲得了4株耐4種重金屬細(xì)菌菌株;其中3株為芽孢桿菌屬，分別為蠟樣芽胞桿菌，蠟狀芽孢桿菌，和1株與巨大芽孢桿菌最高相似度僅為85.37%的極耐錳菌株，該菌株為未知種，另外1株為短桿菌屬細(xì)菌。篩選到的菌株對重金屬具有一定的耐受力，為未來礦區(qū)土地復(fù)墾和微生物生態(tài)修復(fù)提供理論依據(jù)和菌種資源。