李艷，羅栩偉，朱冬梅，楊姣，張英娟，張慧，陳思佳，劉剛，劉學(xué)彬

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院，四川 南充 637000)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，占原發(fā)性肝癌的75%～85%，具有起病隱匿、進展快、易復(fù)發(fā)和預(yù)后差的臨床特點[1-2]。雖然肝癌的治療有了很大的提高，但由于耐藥性和復(fù)發(fā)，死亡率仍然很高，中國每年約有383 000人死于肝癌。miR-122是肝臟含量最豐富的肝特異性微小RNA，占肝臟miRNAs的70%，其表達下調(diào)參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展[3-5]。

超聲靶向微泡破壞(ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD)是指利用超聲波和攜帶靶基因的微泡來實現(xiàn)靶向基因的轉(zhuǎn)染，近年來迅速發(fā)展起來的一種新的基因治療方法[6-7]。它可以通過產(chǎn)生超聲波來提高細胞攝取基因的能力，從而暫時提高細胞和毛細血管的通透性[8]。質(zhì)粒具有高特異性、高敏感性、瞬時表達水平、低耗費和低免疫原性等特點，是UTMD研究的首選載體[9]。Lipofectamine2000是研究中常用的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑，但其介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率有待提高[10]。微泡造影劑作為一種無創(chuàng)性載體攜帶質(zhì)粒，在超聲介導(dǎo)下可顯著提高細胞基因轉(zhuǎn)染率和細胞生存率，但微泡不能攜帶足夠數(shù)量的基因[11-12]?？紤]到脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和UTMD的優(yōu)缺點，本研究小組推測這兩種方法的結(jié)合將會產(chǎn)生更好的轉(zhuǎn)染效果。本研究以肝癌細胞株HCCLM3為對象，構(gòu)建pLMP-miR-122表達載體，應(yīng)用UTMD技術(shù)聯(lián)合脂質(zhì)體介導(dǎo)miRNA-122在HCCLM3細胞中的表達，并探索miRNA-122對人肝癌細胞HCCLM3的生物學(xué)行為的影響，為肝癌的診斷和治療提供新的方向和靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器和試劑

人肝癌細胞系HCCLM3(購自武漢中國細胞研究中心)；無血清高糖細胞 DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone)；100 U/mL penicillin和100 μg/mL streptomycin；磷酸鹽緩沖液(PBS)(HyClone)；胎牛血清(FBS)(HyClone)；0.25%胰酶(HyClone)注射用六氟化硫微泡(SF6；Bracco Suisse SA，Manno，Switzerland)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher)；CCK-8試劑盒(吉凱基因)；總RNA提取試劑盒(TIANGEN)；細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher)；核酸擴增儀(T100，Thermo)；BIO-RAD實時熒光定量PCR儀(ICYCLER IQ5)；核酸微量分光光度計(Eppendorf)；旋渦震蕩器(Eppendorf)；高低速離心機(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)文獻[13]構(gòu)建pLMP-miR-122質(zhì)粒。利用生物信息學(xué)分析pre-miRNA-122啟動子片段并擴增，經(jīng)測序并序列比對分析后進行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 細胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染 (1)細胞培養(yǎng)。人肝癌細胞株HCCLM3培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素。將HCCLM3細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)生長期進行實驗，隔2～3 d傳代1次，細胞消化液為0.25%的胰酶。(2)細胞分組和轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 d將細胞接入6孔板，24 h內(nèi)待細胞生長密度達到50%～60%即可轉(zhuǎn)染,參照脂質(zhì)體 LipofectamineTM 2000說明書轉(zhuǎn)染。將人肝癌細胞株HCCLM3分組如下：A組(空載組)：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒；B組(脂質(zhì)體+質(zhì)粒組)：1 mL培養(yǎng)液加入10 μL Lipofectamine 2000和4 μg pLMP-miR-122質(zhì)粒；C組(超聲微泡+質(zhì)粒+超聲輻照組)：0.9 mL細胞培養(yǎng)液中加入100 μL SF6微泡以及4 μg pLMP-miR-122質(zhì)粒，然后進行超聲輻照，D組(脂質(zhì)體+超聲微泡+質(zhì)粒+超聲輻照組)：0.9 mL細胞培養(yǎng)液中加入10 μL Lipofectamine 2000、100 μL SF6微泡以及4 μg pLMP-miR-122質(zhì)粒，然后進行超聲輻照。超聲輻照條件為：2.0 MHz(超聲造影模式)、機械指數(shù)(MI)為 0.28，超聲輻照40 s。輻照結(jié)束5 h后更換為正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 熒光定量PCR技術(shù)檢測基因表達水平 按照總RNA提取試劑盒說明書，提取轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。應(yīng)用熒光定量PCR(QRT-PCR)技術(shù)檢測各組細胞pre-miRNA-122表達水平。引物序列見表1，U6為內(nèi)源性對照。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)熱15 min；94 ℃，15 s；55 ℃，30 s；70 ℃，30 s；共35個循環(huán)。每個反應(yīng)孔的熒光信號達到設(shè)定閾值時的循環(huán)數(shù)即為Ct值。對檢測得到的miRNA的CT值以相對定量的方法進行數(shù)據(jù)分析：miRNA的相對表達量用2-ΔCt來計算。每個基因重復(fù)反應(yīng)3次，進行獨立實驗3次。選擇空載組、以及轉(zhuǎn)染效率最高的細胞組進行后續(xù)試驗，記為con-LM3組、miR-122-LM3組。

表1 引物序列表

1.2.4 CCK-8檢測各組細胞活性 將con-LM3組、miR-122-LM3組細胞接種到96孔板中(104/孔)，每組各作5個復(fù)孔，貼壁24 h后，即可開始加入10 μL CCK-8試劑孵育2 h后，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(OD值)，作為第1天的細胞活性。共檢測第1～5天的細胞活性。記錄每組5孔的數(shù)據(jù)并取均數(shù)作圖。細胞活性以平均OD值表示。

1.2.5 體外遷移和侵襲實驗 (1)劃痕實驗：通過Wound healing assay觀察con-LM3組、miR-122-LM3組細胞的遷移情況。培養(yǎng)2 d至細胞融合度為80%左右，血清饑餓16 h，以10 μL槍頭劃痕，0 h、24 h顯微鏡下拍照，觀察細胞的遷移能力并計算細胞遷移率。細胞遷移率的計算公式=[遷移距離D(0 h)-遷移距離D(24 h)]/遷移距離 D(0 h)。 (2) Transwell 實驗：通過Transwell實驗分析兩組細胞的侵襲能力，使用直徑6.5 mm的聚碳酸酯過濾膜(8 μm孔徑，BD Biosciences)。細胞(5×104)接種于無血清培養(yǎng)基上室，下室中加入含有20%FBS的DMEM培養(yǎng)基600 μL。孵育48 h后，取出小室，用棉棒拭去上室殘留細胞，小室下面穿膜的細胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS洗去殘留結(jié)晶紫溶液，小室室溫晾干后置于顯微鏡下隨機觀察6個視野并拍照，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。侵襲實驗時，在上室提前加入50 μL基質(zhì)膠(1∶6，美國BD Biosciences)，待膠凝固后加入細胞懸液，其他步驟同遷移。

1.2.6 CCK-8檢測對化療敏感性的影響 將對數(shù)期的con-LM3組、miR-122-LM3組細胞各均分到96孔板中(104/孔)，每組各5個復(fù)孔，貼壁24 h后，分別加入6.25、12.5、25、50、100 μg/L順鉑培養(yǎng)，于加藥后48 h應(yīng)用CCK-8法檢測細胞OD值，方法同前。(OD正常組-OD藥物組)/(OD正常組-OD空白組)×100%=細胞抑制率。細胞存活率=1-細胞抑制率，以細胞存活率繪圖。IC50為細胞抑制率等于 50%時的藥物濃度。

1.2.7 蛋白印跡(Western blotting)檢測抗凋亡蛋白Bcl2的表達 將con-LM3組、miR-122-LM3組細胞均分到六孔板中，長至70%～80%融合后使用裂解液將細胞裂解提取蛋白樣品，BCA蛋白定量試劑盒進行定量。取等量蛋白樣品進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜(NC)膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加一抗4 ℃過夜，洗膜后加二抗孵育1 h。一抗(均購自美國Abcam公司)包括：兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，1∶2 000)，兔抗人Bcl2(1∶500)。常規(guī)增強化學(xué)發(fā)光法曝光、掃描成像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組細胞轉(zhuǎn)染效率

通過QRT-PCR技術(shù)檢測五組細胞的pre-miRNA-122表達水平，提示D組細胞的miR-122表達水平高于其他各組細胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而B、C組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.2 miRNA-122抑制HCCLM3增殖

與con-LM3組比較，miR-122-LM3組細胞生長明顯受到抑制(P<0.05)。并且，我們發(fā)現(xiàn)miR-122-LM3組細胞Bcl2蛋白表達明顯下調(diào)，與con-LM3組細胞相比(P<0.05)。見圖2。

2.3 miRNA-122抑制HCCLM3體外侵襲和遷移能力

劃痕實驗結(jié)果顯示，con-LM3組和miR-122-LM3組細胞的24 h遷移率分別是52%和20%，表明過表達miR-122后細胞遷移明顯受到抑制，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Transwell實驗結(jié)果顯示，miR-122-LM3組平均視野細胞數(shù)明顯少于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見圖3A、圖3B和表2。

組別細胞遷移細胞侵襲con-LM3組(n=3)178±12.493±8.52miR-122-LM3組(n=3)31±6.222±5.12

2.4 miRNA-122對HCCLM3細胞耐藥性的影響

不同濃度的順鉑作用細胞48 h，miR-122-LM3組細胞對順鉑的敏感性高于con-LM3組(P<0.05)，miR-122-LM3組的IC50是(24.12±1.33)μg/L，而con-LM3組細胞的IC50是(52.12±4.96)μg/L。見圖4。

3 討論

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約21～22個核苷酸序列的單鏈非編碼小RNA，在肝臟中表達豐富，其通過調(diào)控特定的靶基因表達在新陳代謝、發(fā)育、凋亡、分化、病毒感染及腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用[14]。研究[15]表明，miRNAs表達水平的變化可能是肝炎、肝癌發(fā)生的關(guān)鍵機制。其中miRNA-122是正常肝組織特異性高表達的miRNA，而在肝癌細胞中的表達顯著下調(diào)[16]。并且，miRNA-122調(diào)控調(diào)節(jié)膽固醇代謝和促進肝細胞的終末分化，它的缺失損傷正常的肝功能，促進肝癌患者的發(fā)病和死亡[17-18]。此外，miR-122的表達水平與 HCC 患者的預(yù)后也密切相關(guān)，表達下調(diào)能夠促進腫瘤轉(zhuǎn)移和進展[19]。miR-122表達受抑制是HCC的特征，表現(xiàn)為侵襲能力增強、腫瘤復(fù)發(fā)和患者生存時間減少，因此miR-122 表達缺失可誘發(fā)肝癌細胞獲得侵襲表型。

常用的基因轉(zhuǎn)染方法(如病毒、脂質(zhì)體等)不適用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染。病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染具有潛在的副作用，而脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染在體內(nèi)的效率極低。目前，已有大量研究[20-23]認為UTMD能有效介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染，具有安全、實用、靶向性強等優(yōu)點，成為基因治療的主要發(fā)展趨勢之一。UTMD產(chǎn)生的空化效應(yīng)是UTMD與脂質(zhì)體結(jié)合介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的主要機制，也是提高脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率的主要原因。并且，新型超聲微泡造影劑的出現(xiàn)進一步提高了空化效應(yīng)和在體外裸DNA轉(zhuǎn)染基因的表達[24-25]。本研究通過聯(lián)合UTMD技術(shù)和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miRNA-122至HCCLM3細胞使其miRNA-122表達上調(diào)，通過RT-qPCR鑒定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的HCCLM3細胞可以穩(wěn)定表達miRNA-122。此外，本研究結(jié)果顯示，與其他方法比較UTMD技術(shù)結(jié)合常規(guī)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法可以增強轉(zhuǎn)染效率。這與Wang等[26]聯(lián)合UTMD和脂質(zhì)體介導(dǎo)乳腺癌細胞增敲減強異黏蛋白(MTDH)表達效率的結(jié)果一致，這將為體內(nèi)基因治療奠定基礎(chǔ)。

與此同時，本研究結(jié)果揭示過表達miRNA-122可以抑制HCCLM3細胞的增殖、侵襲能力，過表達miR-122后抗凋亡蛋白Bcl2表達下調(diào)。Bcl-2是能夠阻止細胞色素c從線粒體釋放到細胞質(zhì)，從而抑制細胞凋亡的抗凋亡因子[27]。此外，順鉑是目前臨床上頻繁使用的一種具有廣譜作用的抗腫瘤藥物，但對 HepG2 細胞作用過程中存在的耐藥性[28]。Wang等[29]的研究揭示miR-122水平可能是腫瘤細胞抗化療的關(guān)鍵因素，于是本研究探索了miRNA-122是否參與肝癌細胞耐藥，結(jié)果顯示miRNA-122可以增加對順鉑的敏感性。雖然，本研究提示肝miR-122可作為抑制腫瘤發(fā)生的促凋亡因子，然而，其具體機制以及miR-122如何被調(diào)控表達的研究還需進一步探索。

綜上，聯(lián)合UTMD技術(shù)和脂質(zhì)體成功轉(zhuǎn)染人肝癌HCCLM3細胞過表達miRNA-122，miRNA-122上調(diào)后可以明顯抑制HCCLM3增殖、遷移和侵襲能力，并且miRNA-122上調(diào)后細胞對化療藥物的敏感性增加。本結(jié)果有望為肝癌的診斷和基因治療提供新的治療靶點和新的思路。