金輝輝，徐斌，黃妍，童玉華，薛瑾，王昕佳，姚建標(biāo)*

1.浙江康恩貝制藥股份有限公司，浙江 杭州 310052；2.浙江省中藥制藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310052；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310052；4.江西天施康中藥股份有限公司，江西 鷹潭 335000

夏天無為罌粟科植物伏生紫堇Corydalisdecumbens(Thunb.)Pers.的干燥塊莖，分布于浙江、江西、江蘇、安徽、湖北、河南等地區(qū)，為國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品[1]。主要化學(xué)成分為生物堿類，此外還含有機(jī)酸類、淀粉、鞣質(zhì)等[2-3]。夏天無具行氣活血，通絡(luò)止痛之功效，文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等具有明顯的藥理作用[4-11]，為民間常用草藥，常用于治療高血壓、中風(fēng)偏癱癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及腰肌勞損等，通常研末沖服、煎湯內(nèi)服[12]。

夏天無配方顆粒是夏天無飲片經(jīng)現(xiàn)代提取技術(shù)及制劑工藝精制而成，在臨床上可以替代夏天無飲片，因此對(duì)其研究有著十分積極的意義。原阿片堿與鹽酸巴馬汀為夏天無的特征性成分，同時(shí)也是其主要有效成分。本研究參照《中藥配方顆粒管理暫行規(guī)定》制備配方顆粒，以此為基礎(chǔ)，建立了夏天無配方顆粒的特征圖譜方法，確定了10個(gè)共有特征峰，為夏天無配方顆粒的質(zhì)量控制及工藝研究提供了參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent1260高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜Q-TOF 6530A；Sartorius BS 201S 電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；DK-S26 水浴鍋(上海精宏)；KQ-250DB 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

原阿片堿(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110853-201404，純度：99.7%)；鹽酸巴馬汀(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110732-201611，純度：86.8%)；延胡索乙素(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110726-201516，純度：99.8%)；D-四氫藥根堿(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：M30J8S38887，純度≥98%)；比枯枯靈(成都普菲德生物有限公司，批號(hào)：150917，純度≥98%)。

夏天無藥材由金華市益康醫(yī)藥有限公司和江西天施康中藥股份有限公司提供，由浙江康恩貝制藥股份有限公司炮制。經(jīng)浙江康恩貝制藥股份有限公司何厚洪高級(jí)工程師鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以三乙胺醋酸溶液(三乙胺8 mL，冰醋酸30 mL，加純水稀釋至1000 mL)為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～15 min，13%A；15～20 min，13%～17%A；20～30 min，17%A；30～50 min，17%～24%A；50～55 min，24%～36%A；55～60 min，36%～95%A)；檢測(cè)波長：285 nm；流速：1 mL min-1，柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 夏天無配方顆粒的制備

參照《中藥配方顆粒管理暫行規(guī)定》，以9批夏天無飲片為源頭，最終制得15批夏天無配方顆粒。制備工藝：取夏天無飲片，加水煎煮3次，每次1 h，加水量依次為6倍、6倍、6倍，濾液濃縮至相對(duì)密度約至1.05～1.10(60 ℃)，干燥，粉碎，加糊精適量，混勻，制粒，即得夏天無配方顆粒。

2.3 對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液制備方法 精密稱取延胡索乙素、原阿片堿、鹽酸巴馬汀、D-四氫藥根堿適量，加甲醇稀釋成每1 mL含延胡索乙素50 μg，原阿片堿30 μg，鹽酸巴馬汀10 μg，D-四氫藥根堿50 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取夏天無配方顆粒1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入氨水1 mL潤濕，再精密加入甲醇30 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中并定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性供試品溶液的制備 取糊精，按2.3.2項(xiàng)下方法，制備陰性供試品溶液。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1專屬性考察 取延胡索乙素、原阿片堿、鹽酸巴馬汀、D-四氫藥根堿混合對(duì)照品溶液、夏天無配方顆粒供試品溶液和陰性供試品溶液按2.1項(xiàng)下方法進(jìn)樣檢測(cè)，陰性供試品溶液無干擾，供試品溶液中色譜峰分離良好，見圖1。方法專屬性良好。

注：A.空白溶液；B.混合對(duì)照品溶液；C.夏天無配方顆粒供試品溶液。圖1 夏天無配方顆粒專屬性考察

2.4.2 精密度試驗(yàn) 按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.18%，儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.35%。供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品，按2.3.2項(xiàng)下方法制備6份，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.31%。該方法重復(fù)性良好。

2.5 特征峰的確定及對(duì)照指紋圖譜的生成

按2.3.2項(xiàng)下方法，制備15批夏天無配方顆粒供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。通過HPLC特征圖譜選取了10個(gè)共有峰作為特征峰，建立了夏天無配方顆粒的對(duì)照特征圖譜，見圖2。其中峰5為原阿片堿，該色譜峰峰形尖銳穩(wěn)定，分離良好，且為夏天無藥材中重要質(zhì)量控制指標(biāo)成分，故確定原阿片堿為參照峰(S峰)。

2.6 相對(duì)保留時(shí)間的確定

通過15批夏天無配方顆粒的HPLC圖，生產(chǎn)對(duì)照指紋圖譜(見圖3)，同時(shí)記錄各共有峰的保留時(shí)間，計(jì)算相對(duì)于S峰的保留時(shí)間值(見表1)。各峰的平均相對(duì)保留時(shí)間值分別為0.190(峰1)、0.287(峰2)、0.827(峰3)、0.952(峰4)、1(S)、1.255(峰6)、1.335(峰7)、1.396(峰8)、1.449(峰9)、1.836(峰10)；RSD分別為0.404%、0.668%、0.233%、0.229%、0%、0.206%、0.361%、0.198%、0.205%、0.243%；將各峰平均相對(duì)保留時(shí)間值定為特征圖譜規(guī)定值，檢測(cè)相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%以內(nèi)。

2.7 特征圖譜峰定性

按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行質(zhì)譜分析。提取峰4、5、9、10成分的二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行解析[13]，再結(jié)合對(duì)照品分析，確定其結(jié)構(gòu)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同廠家不同型號(hào)色譜柱進(jìn)行考察：色譜柱1：(Welch Xtimate?C185-Micron 250 mm×4.6 mm，Part Number：00101-21043，Serial Number：411501757)、色譜柱2：(Welch Utimate?XB-C185-Micron 250 mm×4.6 mm，Part Number：2101.78，Serial Number：211303178)、色譜柱3：(Aglient ZORBAX SB-C185-Micron 250 mm×4.6 mm，Part Number：880975-902，Serial Number：USCL067039)，色譜柱4：(Athena C18120?5-Micron 250 mm×4.6 mm，Part Number：LAEQ-462571，Serial Number：T9370008)。結(jié)果顯示，Aglient SB-C18、Athena C18色譜柱檢測(cè)得到的色譜圖相對(duì)分離度更佳，峰形更為尖銳，且峰更多，能更全面表達(dá)色譜信息，更適宜做特征圖譜，建議用Aglient SB-C18與Athena C18色譜柱。

注：4.D-四氫藥根堿；5.原阿片堿；9.延胡索乙素；10.鹽酸巴馬汀。圖2 夏天無配方顆粒對(duì)照特征圖譜

表1 15批夏天無配方顆粒特征圖譜測(cè)定結(jié)果

圖3 15批夏天無配方顆粒特征圖譜

本實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜柱溫度(20、25、30、35、40 ℃)進(jìn)行考察。發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)色譜圖分離和峰形影響較大，溫度越高峰形越尖銳，分離度也有提高，因此確定40 ℃為最佳柱溫。

在供試品溶液制備時(shí)，考察了不同提取溶劑體系(甲醇-氨水、三氯甲烷-甲醇-氨水、三氯甲烷-氨水)，結(jié)果顯示，三氯甲烷-氨水提取體系有部分峰丟失，三氯甲烷-甲醇-氨水提取體系在0～10 min內(nèi)雜峰比較少。但考慮到三氯甲烷為有毒試劑，標(biāo)準(zhǔn)湯劑為純水提取，且結(jié)合色譜圖峰的分離情況，最終選擇甲醇-氨水體系。

圖4 特征圖譜色譜峰定性

4 結(jié)論

中藥材本身成分復(fù)雜，中醫(yī)藥理論強(qiáng)調(diào)其多成分的整體性，中藥特征圖譜在質(zhì)量評(píng)價(jià)中起著尤為重要的作用。本實(shí)驗(yàn)建立了夏天無配方顆粒的特征圖譜來監(jiān)測(cè)整體質(zhì)量，驗(yàn)證了方法穩(wěn)定性、重復(fù)性等，確立了10個(gè)特征峰；并利用對(duì)照品和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)對(duì)其特征圖譜特征峰進(jìn)行了定性，為夏天無配方顆粒的工藝研究及質(zhì)量控制提供了參考。