易雪麗 陸飛燕 陳曉穎 曾怡

【摘要】目的?構(gòu)建NOC2L基因重組慢病毒并使其在293T細胞中表達。方法?通過設計引物及PCR擴增獲得NOC2L全基因片段，將 pCDH-GFP載體分別用XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切制備線性化載體;NOC2L全基因片段和線性化載體經(jīng)切膠回收后，通過同源重組反應將NOC2L全基因片段連接到線性化的pCDH-GFP載體上，構(gòu)建pCDH-NOC2L-GFP慢病毒表達載體;通過菌落PCR、質(zhì)粒雙酶切、測序等方法對構(gòu)建的NOC2L基因重組慢病毒表達載體進行鑒定，利用構(gòu)建的pCDH-NOC2L-GFP包裝NOC2L慢病毒并使用該慢病毒感染293T細胞。結(jié)果?菌落PCR、質(zhì)粒雙酶切和測序結(jié)果顯示成功將NOC2L基因連接到pCDH-GFP載體上，使用構(gòu)建成功的pCDH-NOC2L-GFP轉(zhuǎn)染293T細胞，能夠成功轉(zhuǎn)染及包裝NOC2L基因重組慢病毒，同時包裝好的NOC2L基因重組慢病毒能夠成功感染293T細胞并過表達293T細胞中的NOC2L基因。

結(jié)論?采用本研究方法能成功構(gòu)建 NOC2L基因重組慢病毒表達載體。

【關(guān)鍵詞】NOC2L;NIR;慢病毒表達載體

中圖分類號：R373?文獻標志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.12.003

【Abstract】Objective?To construct recombinant lentivirus expressing NOC2L gene，and to analyze its expression in 293T cells.

Methods?The full-length NOC2L gene was obtained by PCR amplification from human cDNA library.The pCDH-GFP plasmid was digested with XbaⅠ and BamHⅠ to generate a linearized vector.After the NOC2L full-length gene fragment and the linearized vector were purified by gel extraction，the NOC2L full-length gene fragment was ligated into the linearized pCDH-GFP vector by homologous recombination.Positive clones of the recombinant pCDH-NOC2L-GFP lentivirus expression plasmid were identified by double restriction enzyme digestion and Sanger sequencing.The NOC2L lentivirus was packaged with the constructed pCDH-NOC2L-GFP plasmid and the 293T cells were infected with the NOC2L lentivirus subsequently.

Results?Colony PCR，double restriction enzyme digestion and sequencing results showed that the NOC2L gene was successfully cloned into the pCDH-GFP vector.The recombinant pCDH-NOC2L-GFP plasmid was successfully transfected into 293T cells，and the NOC2L recombinant lentivirus was also successfully packaged.Meanwhile，the NOC2L recombinant lentivirus can successfully infect 293T cells and overexpress the NOC2L gene.

Conclusion?The NOC2L recombinant lentivirus expression vector was successfully constructed by this method.

【Key words】NOC2L;NIR;lentivirus expression vector

NOC2L有6個轉(zhuǎn)錄物，94個直向同源物，是一個核仁相關(guān)的轉(zhuǎn)錄抑制因子。其編碼的NIR蛋白是一種新的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑（INHAT）。組蛋白的乙?；腿ヒ阴；谡婧思毎幕虮磉_調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）和 組 蛋 白 去 乙 酰 化 酶（histone deacetylase，HDAC）可以影響組蛋白的乙?；痆1]。NIR直接與核小體和核心組蛋白結(jié)合，防止HAT的乙?；?，從而起到INHAT的作用，且這一作用不被HDAC抑制劑阻斷。p53作為其相互作用的配偶體，NIR通過與p53結(jié)合來調(diào)節(jié)p53的轉(zhuǎn)錄活性，抑制p53下游基因的轉(zhuǎn)錄[2]。進一步研究結(jié)果顯示，有絲分裂激酶B（Aurora B）作為NIR的另一種相互作用的配偶體，能與NIR直接結(jié)合，形成一個含有Aurora B、NIR和p53的蛋白質(zhì)復合物。Aurora B通過NIR間接地與p53結(jié)合，促進Aurora B介導的p53在DBD的多個位點磷酸化，從而抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性[3]。除了p53之外，NIR還可以與TAp63相結(jié)合，進而抑制TAp63的轉(zhuǎn)錄活性[4]。NOC2L與其他的INHAT一樣，在正常細胞的生長、增殖和分化中發(fā)揮重要作用。Titus等人研究了NOC2L甲基化與乳腺癌的關(guān)系，結(jié)果顯示在Her2、LumA和LumB亞型的乳腺腫瘤中，NOC2L基因高甲基化，在基底樣乳腺腫瘤中低甲基化[5]。而有關(guān)研究顯示NOC2L可能為胰腺癌的易感基因[6]。因此我們期望能通過構(gòu)建NOC2L基因重組慢病毒表達載體，為進一步研究NOC2L基因與各種腫瘤發(fā)生相關(guān)機制奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試劑及儀器

pCDH-GFP質(zhì)粒載體、包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜質(zhì)粒pMD2.G為南京醫(yī)科大學盧春教授惠贈。293T細胞株為本實驗室保存，PCR引物由Takara生物公司合成，PCR試劑盒、DL 15 000 DNA Marker、DL 10 000 DNA Marker、DNA切膠回收試劑盒、real-time PCR （qPCR）試劑盒購自Takara生物公司，限制性內(nèi)切酶購自NEB公司，EasyGeno重組試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、lipofectamine2000購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。研究中主要使用下列儀器：5424R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），PTC-200 PCR儀（美國Bio-Rad公司），DYY-6C 電泳儀（北京市六一儀器廠），NanophtoometerP360超微量分光光度計（美國IMPLEN公司），XRS凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2?方法

1.2.1?NOC2L基因片段制備

根據(jù)GenBank基因庫中登記的NOC2L基因序列設計PCR引物，引物序列如下：

上游引物：ATGGCAGCTGCGGGGAGCCGCAAGAG

下游引物：TCAACACAATGGCCCTGCCTCCCAC

以人全基因組cDNA為模板進行擴增，得到NOC2L基因全長片段。50 μL反應體系如下：模板1 μL，Taq 0.5 μL，2×GC Buffer 25 μL，dNTP Mix 8 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH2O補足50 μL。反應條件如下：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸150 s，72℃加長延伸5 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以NOC2L基因序列及pCDH-GFP載體序列設計PCR引物，在NOC2L基因片段5端和3端分別加入與線性化載體兩端重疊的序列，引物序列如下：

上游引物：CCTCCATAGAAGATTCTAGAGCCACCATGGCAGCTGCGGGGAGCCGCAAGAGGCGCCTGGCGGAGCTGACGGTG

下游引物： TCCTTCGCGGCCGCGGATCCTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCGTCGTCCTCTGAGAGCTGC

以前述獲得的NOC2L全基因PCR擴增產(chǎn)物為模板進行擴增，使擴增的NOC2L基因片段上下游分別帶有與線性化載體兩端互補的序列，反應體系及條件同前述。擴增產(chǎn)物用DNA切膠回收試劑盒按說明書回收并純化凝膠產(chǎn)物，并用紫外分光光度計進行濃度的測定。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?線性化載體制備

用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和BamHⅠ對pCDH-GFP質(zhì)粒載體進行雙酶切。雙酶切反應體系如下：載體1 μg，XbaⅠ1 μL，BamHⅠ1 μL，Cutsmart buffer 5 μL，以ddH2O補足50 μL。反應條件如下：雙酶切體系37℃ 15 min后再65℃ 20 min使酶失活。雙酶切產(chǎn)物用DNA切膠回收試劑盒按說明書回收并純化凝膠產(chǎn)物，并用紫外分光光度計進行濃度的測定。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3?同源重組

將線性化的載體及插入片段進行同源重組。10 μL重組反應體系如下：線性化載體0.01 pmol，插入片段0.05 pmol，2×EasyGeno Assembly Mix 5 μL，以ddH2O補足至10 μL。重組反應體系如下：50℃反應15 min，冰上冷卻5 min。取5 μL上述重組反應產(chǎn)物加入50 μL DH5α感受態(tài)細胞后冰浴30 min;42℃熱激90 s后冰浴150 s;加入350 μL LB液體培養(yǎng)基37℃180 rpm搖45 min;從中取100 μL接種于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆;從培養(yǎng)16 h的平板上挑取單菌落接入4 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中180 rpm、37℃震蕩培養(yǎng)1 h;取1 μL培養(yǎng)液為模板進行菌落PCR鑒定;鑒定使用引物及反應體系均同1.2.1;菌落PCR結(jié)果為陽性克隆的繼續(xù)180 rpm、37℃震蕩培養(yǎng)16 h后按照質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書進行質(zhì)粒提取。將提取質(zhì)粒按照1.2.2經(jīng)雙酶切鑒定陽性后，送廣州艾基生物有限公司進行測序驗證。

1.2.4?NOC2L慢病毒包裝

將構(gòu)建的pCDH-NOC2L-GFP與包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜質(zhì)粒pMD2.G利用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染293T細胞，同時將pCDH-GFP與包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜質(zhì)粒pMD2.G利用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染293T細胞作為陰性對照。轉(zhuǎn)染8 h后將無血清DMEN更換為完全培養(yǎng)基，分別于48 h和72 h觀察熒光蛋白GFP表達情況，同時48 h和72 h分別收取上清，混合后離心吸取上層上清用0.45 μm濾器進行過濾，所得濾液即為包裝好的NOC2L病毒液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5?NOC2L慢病毒感染293T細胞

把293T細胞按照1×105個細胞/孔接種入6孔板中，37℃培養(yǎng)24 h。將包裝好的NOC2L慢病毒及陰性對照慢病毒置于冰上融化。6孔板中的293T細胞吸棄上清后，取200 μL完全融化的慢病毒加入到6孔板中，加入無血清DMEM補足2 mL培養(yǎng)體積。培養(yǎng)8 h后將含有慢病毒的無血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)至96 h后觀察熒光蛋白GFP表達情況，同時收集細胞提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后使用qPCR檢測NOC2L表達情況。

1.3?統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料符合正態(tài)分布，采用相對表達量2-△△Ct法比較基因的表達差異。組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2?結(jié)?果

2.1?NOC2L基因片段制備

以人全基因組cDNA為模板進行擴增后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在約2800 bp處出現(xiàn)條帶，與預期目的條帶位置相符，電泳結(jié)果見圖1。以該NOC2L全基因組片段為模板進行擴增，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在約2800 bp處出現(xiàn)條帶，產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，獲得30 μL濃度為23.30 ng/μL的插入片段。

2.2?線性化載體制備

對pCDH-GFP質(zhì)粒進行雙酶切后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在約7500 bp處出現(xiàn)條帶，電泳結(jié)果見圖2。雙酶切產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，獲得30 μL濃度為24.20 ng/μL的線性化載體。

2.3?同源重組

將NOC2L基因片段及線性化載體進行同源重組后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，接種至含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。過夜培養(yǎng)后平板上有2個菌落生長，分別挑取單個菌落搖菌后進行菌落PCR驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示只有1個菌落在約2800 bp處出現(xiàn)目的條帶，電泳圖結(jié)果見圖3。取菌落PCR陽性菌液繼續(xù)培養(yǎng)后進行質(zhì)粒小量提取，將提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在2800 bp及7500 bp處分別出現(xiàn)條帶，電泳圖結(jié)果見圖4。送菌落PCR及雙酶切鑒定均為陽性的克隆質(zhì)粒到廣州艾基生物有限公司進行測序，結(jié)果回報顯示，重組的pCDH-NOC2L-GFP中的NOC2L序列與GenBank中登記的NOC2L基因100%同源。

2.4?NOC2L慢病毒包裝

轉(zhuǎn)染48 h后pCDH-NOC2L-GFP組及pCDH-GFP組均可看到熒光蛋白GFP表達，熒光視野及明場視野對比圖見圖5。

2.5?NOC2L慢病毒感染293T細胞

感染96 h后pCDH-NOC2L-GFP組及pCDH-GFP組均可看到熒光蛋白GFP表達。提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后使用qPCR檢測NOC2L表達，檢測結(jié)果顯示兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），pCDH-NOC2L-GFP組相對于pCDH-GFP組NOC2L上調(diào)。見表1。

3?討?論

NOC2L除了作為INHAT發(fā)揮作用外，還有研究證實其是皮膚發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其編碼的NIR調(diào)節(jié)表皮發(fā)育中的角蛋白、整聯(lián)蛋白和層粘連蛋白等必需因子的表達[7]。p63基因是p53家族成員之一，與p53有高度的同源性，是一種序列特異性轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)上皮干細胞維持和上皮分化。p63可以編碼具有反式激活域、氨基端全長的TAp63亞型和氨基端截短的ΔNp63亞型[8～9]。研究顯示，NIR的中心部分可以與TAp63的反式激活結(jié)構(gòu)域和C末端寡聚化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制其乙?；痆4]。NIR主要定位于細胞核中，稱為Noc2p，參與60S核糖體亞基的成熟，在不同的人類細胞系中普遍表達，主要是通過影響p53的修飾而不是影響p53的蛋白水平起作用[10]。p53是一種調(diào)節(jié)各種重要生物過程的轉(zhuǎn)錄因子，包括細胞凋亡、細胞周期停滯和衰老。p53可分為野生型p53與突變型p53，當野生型p53轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔冃蚿53時，p53作為原癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起作用，目前超過50%的人類癌癥中都發(fā)現(xiàn)了p53突變[11～13]。MDM2 作為p53 的下游效應基因，可以與p53的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，即 N端結(jié)合，從而抑制p53對其下游基因的轉(zhuǎn)錄促進功能[14]。而Heyne等人的研究結(jié)果顯示，NIR可以直接與MDM2結(jié)合，與p53一起形成三元復合物。其中NIR作為INHAT起著阻斷p53與MDM2乙?；淖饔?，與MDM2合作抑制p53誘導的反式激活[15]。NOC2L參與對p53及其下游效應基因表達的調(diào)控，同時已有研究證明NOC2L的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生有聯(lián)系，因此我們認為NOC2L可能通過調(diào)節(jié)p53及其下游基因表達參與到多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中。同時我們期望能夠通過NOC2L慢病毒來構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系以研究NOC2L與各種腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷病毒（HIV）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達，具有感染效率高、感染譜廣和穩(wěn)定表達等優(yōu)勢[16]。目前，慢病毒已經(jīng)非常廣泛地被用于構(gòu)建穩(wěn)定表達的哺乳動物細胞系，在構(gòu)建慢病毒載體時可以在質(zhì)粒中插入螢光素酶基因、綠色和紅色熒光蛋白基因等報告基因，通過這些報告基因?qū)?gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系進行篩選，有效提高轉(zhuǎn)染效率。陳平等研究證實聯(lián)合使用慢病毒表達載體和流式細胞儀分選技術(shù)可以快速篩選出穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的293T細胞系[17]。本研究構(gòu)建了NOC2L基因重組慢病毒表達載體，載體質(zhì)粒中插入有綠色熒光蛋白基因報告基因，可以通過報告基因?qū)?gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系進行篩選，提高轉(zhuǎn)染效率。我們下一步將利用構(gòu)建的載體研究NOC2L基因在不同腫瘤中對p53及其下游基因的調(diào)控情況，以明確NOC2L在各種腫瘤發(fā)生機制中所起的作用。

參?考?文?獻

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（收稿日期：2019-09-25?修回日期：2019-11-25）

（編輯：王琳葵?梁明佩）