李佩璇 陳法志 李秀麗 戢小梅 陳志偉 翟敬華

摘要：為提高鳳丹牡丹（Paeonia suffruticosa Fengdan）葉的多酚提取率，采用纖維素酶法提取葉中的多酚，以多酚提取量為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取纖維素酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH 4個(gè)因變量，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，建立各因變量與響應(yīng)值之間的數(shù)學(xué)模型，確定最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，曲面回歸方程擬合性良好，其中纖維素酶用量和酶解溫度的交互作用顯著，得到多酚的最優(yōu)工藝條件為纖維素酶用量150 U/mL、pH 5.0、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間105 min，在此條件下，多酚提取量達(dá)到34.66 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值35.10 mg/g接近。鳳丹葉片提取液對(duì)DPPH·清除率在提取液濃度為0.06 mg/mL時(shí)達(dá)到82.15%;對(duì)·OH清除率在提取液濃度為0.32 mg/mL時(shí)達(dá)到27.10%;鐵氰化鉀還原力在提取液濃度為10 mg/mL時(shí)，吸光度為3.41。

關(guān)鍵詞：鳳丹牡丹（Paeonia suffruticosa Fengdan）;多酚;酶法提取;響應(yīng)面設(shè)計(jì);抗氧化活性

中圖分類號(hào)：S567.1+5 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）24-0187-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.046 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Determination of in vitro antibacterial activity of antioxidant and

the extraction of Fengdan peony polyphenols

LI Pei-xuan，CHEN Fa-zhi，LI Xiu-li，JI Xiao-mei，CHEN Zhi-wei，ZHAI Jing-hua

（Institute of Forestry and Fruit Tree，Wuhan Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430075，China）

Abstract： In order to improve the comprehensive utilization rate of peony（Paeonia suffruticosa Fengdan） leaf of Fengdan resources， the polyphenols in the leaves of peony were extracted by cellulase method， and the polyphenols were used as the index. The effects of cellulase concentration， enzymatic hydrolysis temperature， enzymatic hydrolysis time and pH value on the extraction of polyphenols in peony leaves were investigated by response surface. The results showed that the best condition for extraction of polyphenols from peony leaves by cellulase was： when the concentration of cellulase was 150 U/mL， the pH was 5.0， the enzymatic time was 105 min， the temperature of enzymatic hydrolysis was 50 ℃. Under this condition， the theoretical prediction value of polyphenol content was 34.66 mg/g. The antioxidant activity of the best condition for extraction was examined. The DPPH· scavenging abilities of Fengdan leaf extract reached 82.15% when the extract concentration was 0.06 mg/mL; the hydroxyl scavenging abilities reached 27.10% when the concentration was 0.32 mg/mL;reducing abilities of the potassium ferricyanide absorbance was 3.41， when the concentration of the extract was 10 mg/mL.

Key words： Fengdan peony（Paeonia suffruticosa Fengdan）; polyphenols; enzyme extraction; design of response surface; dntioxidant activity

牡丹（Paeonia suffruticosa）代表著富貴，外形美麗，具有“花中之王”之稱，有較高的經(jīng)濟(jì)、觀賞價(jià)值[1]。鳳丹牡丹是由牡丹野生原種楊山牡丹經(jīng)過長(zhǎng)期栽培演化形成的觀賞、食用兼藥用的品種群，是中國油用牡丹栽培的主要類型，在山東、河南、河北、陜西、安徽、湖北、四川、江蘇、湖南等省廣泛栽培。鳳丹牡丹的花、果實(shí)、根、葉均具有較高的開發(fā)利用價(jià)值，鳳丹牡丹子油、花先后被國家衛(wèi)生健康委員會(huì)批準(zhǔn)為新資源食品。牡丹的花、葉中含有大量的酚類物質(zhì)，具有提高免疫功能、抗心血管疾病、抗炎、抗腫瘤等多種生物藥理活性[2-4]，在化妝品、食品添加劑等領(lǐng)域具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景[5]。史國安等[6]、吳龍奇等[7]、劉建華等[8]研究對(duì)比了不同種類的牡丹花、葉中營養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)其均含有大量的多酚類物質(zhì)、礦物質(zhì)、微量元素及氨基酸等，且具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

多酚類物質(zhì)是植物中常見的一種成分，主要包括類黃酮、酚酸、花青素等物質(zhì)，具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病、抗炎抑菌、降血壓等功效，有人類健康衛(wèi)士之稱[9-11]。國內(nèi)外關(guān)于多酚的提取方法有溶劑提取法（Solvent Extraction，SE）、微波提取法（Microwave Assisted Extraction，MAE）、超聲輔助提取法（Ultrasound Assisted Extraction，UAE）、超臨界流體提取法（Supercritical Fluid Extraction，SFE）、酶法提取（Enzyme Extraction，EE）等[12]。與有機(jī)溶劑提取、超聲輔助提取以及微波提取在規(guī)?；a(chǎn)時(shí)的局限性相比，酶法提取具有對(duì)提取設(shè)備要求低、反應(yīng)溫和、反應(yīng)過程簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[13]。近年來，酶法提取已被廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的提取和研究中，而關(guān)于鳳丹牡丹多酚提取的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究采取酶法提取鳳丹牡丹葉中多酚物質(zhì)，并通過響應(yīng)面優(yōu)化得到最優(yōu)的工藝條件，為鳳丹牡丹資源綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

1.1.1 ?材料 ?鳳丹牡丹葉采于2017年6月，采自武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林業(yè)果樹研究所鄭店基地種植的5年生鳳丹牡丹實(shí)生苗木。

1.1.2 ?試劑 ?沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海源葉生物科技有限公司;纖維素酶，購自日本Yakult工業(yè)股份有限公司;二苯代苦味?；杂苫―PPH）， 購自美國Sigma公司;其他試劑未加說明均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 ?儀器設(shè)備

ME203E型電子天平，i8型雙光束紫外/可見分光光度計(jì)，EMS-50-雙列十孔恒溫水浴鍋，TGL-20M高速離心機(jī)，TGCXN-2B超聲循環(huán)提取機(jī)。

1.3 ?試驗(yàn)方法

1.3.1 ?鳳丹牡丹葉纖維素酶解處理與提取 ?取新鮮的鳳丹牡丹葉，洗凈后自然晾干水分，50 ℃下真空干燥24 h，粉碎成粉末狀，備用。取已粉碎牡丹葉片粉末1 g，在不同工藝下進(jìn)行酶解后離心，保留上清液，對(duì)沉淀物進(jìn)行水提（料液比1∶20，溫度50 ℃，攪拌1 h）后離心，混合2次上清液，定容至100 mL。

1.3.2 ?多酚含量的測(cè)定 ?多酚含量的測(cè)定參照張亮亮等[14]的方法，求得回歸方程為y=7.64x+0.254，R2=0.991 3。

1.3.3 ?單因素試驗(yàn)

1）纖維素酶用量的選擇。準(zhǔn)確稱取已處理好的1 g鳳丹牡丹葉粉末，分別加入濃度為50、100、150、200、250 U/mL的纖維素酶溶液1 mL，在酶解溫度50 ℃、pH 5.0的條件下酶解100 min，測(cè)定不同纖維素酶用量對(duì)多酚提取量的影響。

2）pH的選擇。準(zhǔn)確稱取已處理好的1 g鳳丹牡丹葉粉末，加入濃度150 U/mL的纖維素酶溶液1 mL，在酶解溫度50 ℃條件下，分別在pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的條件下酶解100 min，測(cè)定不同pH對(duì)多酚提取量的影響。

3）酶解時(shí)間的選擇。準(zhǔn)確稱取已處理好的1 g鳳丹牡丹葉粉末，加入濃度150 U/mL的纖維素酶溶液1 mL，在酶解溫度50 ℃、pH 5.0的條件下分別酶解40、60、80、100、120 min，測(cè)定不同酶解時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響。

4）酶解溫度的選擇。準(zhǔn)確稱取已處理好的1 g鳳丹牡丹葉粉末，加入濃度150 U/mL的纖維素酶溶液1 mL、調(diào)節(jié)pH至5.0，分別在40、45、50、55、60 ℃溫度下提取100 min，測(cè)定不同酶解溫度對(duì)多酚提取量的影響。

1.3.4 ?響應(yīng)面試驗(yàn) ?根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，以多酚提取量（Y）為響應(yīng)值，以酶用量（A）、pH（B）、酶解時(shí)間（C）、酶解溫度（D）為因變量，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，因素與水平見表1。

1.3.5 ?DPPH自由基清除率的測(cè)定 ?參照趙鑫等[15]的方法，將原液濃度調(diào)整為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL。

1.3.6 ?羥基自由基清除率的測(cè)定 ?參照陳佳齡等[16]的方法，將加入原液的量調(diào)整為稀釋10倍后的原液0.16、0.20、0.24、0.28、0.32 mL。

1.3.7 ?鐵氰化鉀還原力的測(cè)定 ?參照秦建華等[17]的方法，吸光度越高，代表還原力越強(qiáng)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?纖維素酶法提取鳳丹牡丹多酚的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 ?酶用量對(duì)鳳丹牡丹葉多酚提取量的影響 ?由圖1可知，在考察濃度范圍內(nèi)，多酚提取量隨纖維素酶用量的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)酶用量為150 U/mL時(shí)，多酚提取量最大。其原因主要為酶用量增加會(huì)加快酶促反應(yīng)速率，細(xì)胞壁裂解加速，多酚物質(zhì)溶出;但當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí)，酶促反應(yīng)達(dá)到平衡，且酶蛋白分子的聚集也阻礙了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的擴(kuò)散。因此，選取酶的最適用量為150 U/mL。

2.1.2 ?pH對(duì)鳳丹牡丹葉多酚提取量的影響 ?由圖2可知，隨著反應(yīng)體系pH增大，多酚提取量呈先升高后下降趨勢(shì)，當(dāng)pH為5.0時(shí)，多酚提取量達(dá)到最大。原因可能是pH對(duì)酶活影響較大，酶在適宜的pH下活力最強(qiáng)，相反pH過高或過低都會(huì)影響酶活。因此，選取最適pH為5.0。

2.1.3 ?酶解時(shí)間對(duì)鳳丹牡丹葉多酚提取量的影響 ?由圖3可知，在考察時(shí)間范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚提取量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為100 min時(shí)，多酚提取量開始呈緩慢下降趨勢(shì)。其原因可能隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)多酚物質(zhì)可以充分溶出，但時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致多酚類物質(zhì)被氧化。因此，選取最適的酶解時(shí)間為100 min。