汪宏才 汪最 羅玲 王紅琳 盧琴 張蓉蓉 張騰飛 溫國元 羅青平

摘要：為探明湖北省地方雞種雞場禽白血病凈化后出現(xiàn)反彈的原因，通過病毒分離、PCR擴增、基因測序及分子生物學(xué)分析，有針對性地檢測了種雞場活疫苗ALV污染情況。結(jié)果表明，從活疫苗中分離出一株ALV是外源性ALV-J亞群病毒。

關(guān)鍵詞：禽白血病;活疫苗;污染;分離;鑒定

中圖分類號：S831.7 ? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）24-0167-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.040 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Isolation and identification of attenuated vaccine ALV

from Hubei local chicken breeding farm

WANG Hong-cai，WANG Zui，LUO Ling，WANG Hong-lin，LU Qin，ZHANG Rong-rong，

ZHNAG Teng-fei，WEN Guo-yuan，LUO Qing-ping

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Sciences，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Prevention and Control Agents for Animal Bacteriosis/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding，Wuhan 430064，China）

Abstract： In order to find out the cause of rebound of avian leukosis after purification in local chicken farms， the contamination of live vaccine ALV in chicken farms was detected. Virus isolation， PCR amplification， gene sequencing and molecular biological analysis showed that an ALV strain isolated from live vaccine was an exogenous ALV-J subgroup virus.

Key words： Avian leukemia; live vaccine; contamination; isolation; identification

禽白血?。ˋvian leukosis）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的禽類多種腫瘤性疾病的總稱，該病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科（Retroviridae）α逆轉(zhuǎn)錄病毒屬（Alpharetrovirus）[1]。ALV既能通過種蛋垂直傳播，也能通過個體之間直接接觸發(fā)生水平傳播。而接種污染了ALV的活疫苗是容易忽視的傳播途徑，國內(nèi)外學(xué)者曾多次報道從禽用活疫苗中檢測出ALV。Zavala等[2]、Silva等[3]、Fadly等[4]、Barbosa等[5]從馬立克疫苗中檢測出ALV，F(xiàn)adly等[6]從雞痘疫苗中檢出ALV。畢玉彧等[7]應(yīng)用PCR方法在3個種雞場18份活疫苗樣品中檢測出ALV污染。

目前，控制禽白血病的主要措施仍是實施凈化和加強種雞場生物安全。湖北省部分種雞場在實施凈化后，ALV p27陽性率降低至5%以下，第二年又升高至10%左右。為了調(diào)查原因，對部分種雞場的活疫苗進行了ALV分離與鑒定，將結(jié)果報告如下。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試劑 ?疫苗主要從種雞場臨床使用的疫苗中隨機抽取;禽白血病ELISA抗原診斷試劑盒，購自IDEXX公司;RNA提取試劑為AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒;PCR試劑購自寶生物工程（大連）有限公司;禽白血病檢測引物和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。新城疫、法氏囊、傳染性支氣管炎等陽性血清由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病團隊保存。

1.1.2 ?儀器 ?Multiscan MK3酶標(biāo)儀，Bio-Rad IQ5熒光定量PCR儀，Applied Biosystems Simpliamp PCR儀。

1.2 ?方法

1.2.1 ?ELISA方法檢測 ?將疫苗樣品用PBS稀釋后，加入相應(yīng)的抗血清中和60 min后，10 000 r/min離心取上清液經(jīng)0.22 μm的濾器過濾除菌，然后接種DF-1傳代細(xì)胞，37 ℃感作1 h，加入細(xì)胞維持液37 ℃培養(yǎng)5～7 d。連續(xù)培養(yǎng)2代后，將細(xì)胞反復(fù)凍融3次，吸取細(xì)胞上清液，用IDEXX ELISA抗原檢測試劑盒進行檢測，按照試劑盒說明書的要求進行操作，S/P>0.2判定為陽性。

1.2.2 ?陽性樣品gp85基因的RT-PCR擴增 ?采用RT-PCR方法進行擴增完整的gp85基因[8]，產(chǎn)物大小約為950 bp，上下游引物分別為：gp85-F：5′-GGT

GGGGGGAGTTCATCT-3′;gp85-R：5′-GCGAGAGA

CGACTCAGCG-3′。已知ALV-J毒株感染細(xì)胞DNA作為陽性對照，未感染DF-1細(xì)胞基因組DNA作為陰性對照。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，按文獻[9]的方法對PCR擴增產(chǎn)物進行回收、連接、轉(zhuǎn)化，然后將PCR鑒定陽性菌送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 ?序列拼接和結(jié)果分析 ?將測序文件用DNASTAR軟件中SeqMan軟件包進行序列裝配和拼接，將拼接后的序列與GenBank中已發(fā)表的亞群序列進行比對，判定亞型種類。A亞群M37980（RSA株）、DQ365814（MQNCSU株）;B亞群AF052428（Schmidt-Ruppin B株）;C亞群J02342（Prague C株）;D亞群D10652（Schmidt-Ruppin D株）;E亞群M12172（RAV-0株、EF467236（SD0501株）、AY013303（ev-1株）;J亞群Z46390（HPRS-103株）、AF247391（HC1株）、DQ115805（NX0101株）、AY897219（HN0001株）、EU264064（SD07LK1株）;K亞群HM582658（TW-3593株）[10]等。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?活疫苗樣品直接ELISA檢測結(jié)果

活疫苗樣品經(jīng)DF-1細(xì)胞培養(yǎng)后，取細(xì)胞上清液使用ELISA抗原檢測試劑盒進行檢測，結(jié)果表明，有1個樣品孔呈陽性。

2.2 ?活疫苗樣品RT-PCR檢測結(jié)果

ELISA陽性樣品經(jīng)RT-PCR擴增后，目的條帶大小為924 bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3 ?序列拼接

樣品經(jīng)正反向測序后，獲得兩個序列峰圖原始數(shù)據(jù)，使用DNASTAR軟件中SeqMan程序進行組裝拼接。先除去兩端雜峰，然后進行組裝拼接，手工校正錯誤堿基，最后導(dǎo)出一致性序列，即為分離病毒的gp85基因核苷酸序列，長度為924 bp。與HPRS103原型株相比，核苷酸有18個位點發(fā)生突變（圖2）。

2.4 ?序列的基因分群

從NCBI下載ALV亞群代表株序列，提取gp85基因序列，通過DNAStar軟件Megalign程序進行多重比對并繪制進化樹（圖3）。從進化樹可以看出，新分離的ALV毒株與J亞群的HPRS103處于同一分支，屬于外源性ALV-J亞群病毒。

3 ?討論

中國很多種雞場均在開展禽白血病的凈化工作，且取得較好的成績，部分種雞場已達(dá)到國家凈化標(biāo)準(zhǔn)。如果不慎使用ALV污染的活疫苗，將會出現(xiàn)ALV反彈，嚴(yán)重影響禽白血病的凈化進展。程合剛等[11]對山東某雞場送檢的國內(nèi)及國外疫苗公司生產(chǎn)的7個不同批次的CVI988/Rispens疫苗，發(fā)現(xiàn)存在E亞群污染。由于種雞場使用活疫苗品種多、次數(shù)多，因此增加了造成ALV的傳播風(fēng)險。胡曉苗等[12]采用ELISA方法和PCR方法對國內(nèi)外禽用活疫苗隨機抽樣進行了檢測，結(jié)果顯示雞傳染性法氏囊B87株、雞痘、雞傳染性喉氣管炎和新城疫等疫苗呈陽性。欒懷彪等[13]對檢測弱毒疫苗中低劑量禽白血病病毒（ALV）污染的核酸斑點雜交法和ELISA進行了比較。在利用經(jīng)典的SPF雞檢查法檢測弱毒疫苗中ALV污染時，結(jié)合對病原核酸的檢測有助于節(jié)省檢測時間和降低漏檢率。因此，加強種雞場禽用活疫苗的ALV污染檢測，對禽白血病凈化狀態(tài)的維持起到重要作用。

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