趙慶楓 高巨 董鳳華 丁壯 陳鵬舉

摘要：通過選育北蟲草菌種，以0.1、0.3、0.5 mL接種在360日齡無公害雞蛋尿囊腔和卵黃囊腔內(nèi)，以噴霧干燥蛋蟲草粉質(zhì)量為指標(biāo)，考察北蟲草在雞蛋內(nèi)培養(yǎng)與制備的影響因素。結(jié)果表明，在尿囊腔內(nèi)接種0.3 mL菌種培養(yǎng)18日齡時(shí)，菌絲體生長明顯，蛋蟲草粉質(zhì)量顯著增加。雞蛋是較好的具備多種營養(yǎng)元素的單一培養(yǎng)基，接種北蟲草菌種成功培育蛋蟲草，突破真菌微生物在液體、固體培養(yǎng)基的生長模式，簡單易行、周期短、產(chǎn)量高，為工業(yè)化生產(chǎn)北蟲草提供了新的思路和方法。

關(guān)鍵詞：北蟲草菌種;培養(yǎng)基;尿囊腔;蟲草菌絲體;蛋蟲草

中圖分類號(hào)：S831 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：1007-273X（2019）12-0010-04

隨著畜禽傳染病的混合感染、慢性病、免疫抑制性和腫瘤性疾病的發(fā)生，免疫增強(qiáng)劑成為臨床應(yīng)用醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最活躍的研究之一[1]。北冬蟲夏草又名北蟲草、蛹蟲草，與冬蟲夏草的有效成分、營養(yǎng)價(jià)值和藥理作用相似[2，3]，具有調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫、抗腫瘤、保肝護(hù)腎等作用，將其作為免疫增強(qiáng)劑的研究越來越多[4-6]。雞蛋內(nèi)含有大量的營養(yǎng)元素，理論上能滿足北蟲草菌生長需求[7，8]，適合工廠化、規(guī)?；a(chǎn)。

試驗(yàn)通過優(yōu)化固態(tài)和液體培養(yǎng)基，選育北蟲草菌種，按照一定劑量將北蟲草菌種分別接種在無公害雞蛋尿囊腔和卵黃囊腔內(nèi)，在溫度、濕度、暗環(huán)境下培養(yǎng)一定時(shí)期后，根據(jù)接種劑量、部位和時(shí)間噴霧干燥蛋蟲草，以蛋蟲草粉重量為考察指標(biāo)，研究北蟲草菌種在雞蛋內(nèi)生長發(fā)育最優(yōu)條件，確立合適的培養(yǎng)、制備條件，為工業(yè)化生產(chǎn)北蟲草提供技術(shù)依據(jù)和參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

北蟲草菌種來源于河北省科學(xué)院微生物研究所食用菌研究室，360日齡無公害雞蛋由商水縣為農(nóng)養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。

1.2 ?試劑與儀器

高錳酸鉀、葡萄糖、KH2PO4、MgSO4、瓊脂、蛋白胨、β-環(huán)狀糊精[9]等均為分析純，75%乙醇，液體石蠟。

LDZH-100KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），PV-30/70型超凈工作臺(tái)（榮事達(dá)有限公司），SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），SY-6000型小型噴霧干燥儀（上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備工程公司）。

1.3 ?方法

1.3.1 ?固體及液體培養(yǎng)基配伍 ?前期經(jīng)多次配伍試驗(yàn)，優(yōu)化固體培養(yǎng)基[10，11]為土豆200.0 g、葡萄糖20.0 g、KH2PO4 2.5 g、MgSO4 1.5 g、瓊脂20.0 g，補(bǔ)水至1 000 mL，pH為7.0。液體培養(yǎng)基為葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、蛋白胨10.0 g、KH2PO4 3.0 g、MgSO4 1.5 g，超純水1 000 mL，pH為7.0。

1.3.2 ?菌種篩選、復(fù)壯與保存 ?將北蟲草菌種在固體培養(yǎng)基斜面上劃線，28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，得到活化的北蟲草菌種，重新選擇、挑取菌落塊接種在固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)7 d，然后挑取菌落塊于液體培養(yǎng)基中，三角瓶裝液量為300 mL/L，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)7～10 d，得到活化的北蟲草種子液[12]。

1.3.3 ?無公害雞蛋選擇 ?選擇同一批360日齡蛋雞，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同，雞蛋收集前15 d雞群未飼喂藥物，環(huán)境、飼料、飲水、防疫措施等均符合無公害雞蛋標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)采集180枚雞蛋。

1.3.4 ?消毒 ?雞蛋表面用無菌紗布擦拭后放入0.1%的高錳酸鉀清洗1 min，再用75%乙醇消毒后備用。

1.3.5 ?接種 ?雞蛋打孔后，用1 mL無菌針在尿囊腔和卵黃囊腔內(nèi)接種北蟲草菌種低劑量（0.1 mL）、中劑量（0.3 mL）各2組，在卵黃囊腔內(nèi)接種高劑量（0.5 mL）菌種1組，對照組雞蛋不接種菌種，每組30枚雞蛋。

1.3.6 ?培養(yǎng) ?參考北蟲草對生長環(huán)境的要求[13，14]，雞蛋尿囊腔或卵黃囊腔內(nèi)接種前3 d在20 ℃、濕度60%的恒溫培養(yǎng)箱光照環(huán)境下培養(yǎng)，后3 d在23 ℃、濕度70%恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗環(huán)境下培養(yǎng)。

1.3.7 ?噴霧干燥 ?于雞蛋氣室處破殼剝離蛋殼，在培養(yǎng)6、12、18、24日齡時(shí)，各取樣品50 mL，加入超純水、粉碎均質(zhì)后采用4層紗布過濾，根據(jù)前期試驗(yàn)優(yōu)化的工藝標(biāo)準(zhǔn)：進(jìn)風(fēng)溫度150 ℃、進(jìn)樣量300 mL/h、空氣流量600 L/h、干燥劑比例4%進(jìn)行噴霧干燥[15-17]、稱重，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 ?數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0進(jìn)行單因素方差分析，各組間數(shù)據(jù)的平均值采用鄧氏多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，測定結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?北蟲草菌種接種劑量對蛋蟲草粉質(zhì)量的影響

低、中劑量組噴霧干燥的蛋蟲草粉質(zhì)量比對照組增20.75%、34.95%，差異顯著（P<0.05）;高劑量組噴霧干燥的蛋蟲草粉質(zhì)量比對照組增加5.23%，差異不顯著（P>0.05）。中劑量組比低劑量組增加11.76%，差異極顯著（P<0.01）。高劑量組比對照組增加5.23%，差異不顯著（P>0.05），比低劑量組減少14.74%，差異顯著（P<0.05），比中劑量組減少28.24%，差異顯著（P<0.05）（表1）。

2.2 ?雞蛋接種部位對蛋蟲草粉質(zhì)量的影響

尿囊腔、卵黃囊腔噴霧干燥的蛋蟲草粉質(zhì)量比對照組增加34.76%、15.70%，差異顯著（P<0.05）。卵黃囊腔比尿囊腔噴霧干燥的蛋蟲草粉質(zhì)量減少16.47%，差異顯著（P<0.05）（表2）。

2.3 ?接種培養(yǎng)時(shí)間對蛋蟲草粉質(zhì)量的影響

6日齡噴霧干燥的蛋蟲草粉質(zhì)量比對照組增加8.03%，差異不顯著（P>0.05）。12日齡噴霧干燥的蛋蟲草粉質(zhì)量比對照組增加11.34%，差異顯著（P<0.05），比6日齡增加3.07%，差異顯著（P<0.05）。18日齡噴霧干燥的蛋蟲草粉質(zhì)量比對照組增加23.21%，差異顯著（P<0.05）;比6日齡增加14.05%，差異顯著（P<0.05）;比12日齡增加10.66%，差異顯著（P<0.05）。24日齡噴霧干燥的蛋蟲草粉質(zhì)量比對照組增加3.49%，差異不顯著（P>0.05）;比6日齡減少4.38%，差異顯著（P<0.05）;比12日齡減少7.59%，差異顯著（P>0.05）;比18日齡減少19.06%，差異顯著（P<0.05）（表3）。

3 ?討論

3.1 ?接種劑量對蛋蟲草發(fā)酵培養(yǎng)的影響

王蓉等[18]研究人工培養(yǎng)北蟲草的接種菌種量為2.5～5.0 mL，但在雞蛋內(nèi)接種北蟲草菌種的研究目前還未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，在雞蛋內(nèi)接種低劑量北蟲草菌種，蛋殼膜增厚，雞蛋內(nèi)菌絲體生長發(fā)育良好，蛋蟲草粉質(zhì)量比普通雞蛋明顯增加，成功培育出蛋蟲草，雞蛋內(nèi)的氮源、碳源能滿足北蟲草菌種的生長發(fā)育，突破真菌微生物在液體、固體培養(yǎng)基的生長模式。尤其接種中劑量北蟲草菌種時(shí)，菌絲和蛋殼膜形成一體，菌絲體比低劑量北蟲草菌種生長發(fā)育更好，蛋蟲草粉質(zhì)量極顯著增加，證明雞蛋內(nèi)的營養(yǎng)能滿足一定劑量菌種的正常生長發(fā)育。但當(dāng)接種劑量過大時(shí)，蛋殼膜表現(xiàn)不明顯，菌絲體生長發(fā)育受阻，蛋蟲草粉質(zhì)量比低劑量、中劑量明顯減少，說明雞蛋內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)數(shù)量有限，不能滿足足量的菌種生長發(fā)育，以接種中劑量時(shí)（0.3 mL）生長發(fā)育良好（表4、圖1、圖2）。

3.2 ?接種部位對蛋蟲草發(fā)酵培養(yǎng)的影響

接種部位對蛋蟲草發(fā)酵培養(yǎng)的影響結(jié)果和方華舟等[19]研究一致，在北蟲草菌種培養(yǎng)中加雞蛋為外源氮源效果良好，試驗(yàn)和對照組雞蛋相比較，無論接種在尿囊腔或者卵黃囊腔內(nèi)，菌絲體在蛋殼膜上生長，蛋殼膜逐漸增厚，蛋殼內(nèi)環(huán)境發(fā)生不同程度的改變，北蟲草菌種均能生長發(fā)育，但以接種在尿囊腔內(nèi)的菌絲體變化明顯，噴霧干燥的蛋蟲草粉質(zhì)量增加顯著（表4、圖3和圖4）。

3.3 ?培養(yǎng)日齡對蛋蟲草發(fā)酵培養(yǎng)的影響

通過觀察在雞蛋內(nèi)接種3日齡后，北蟲草菌絲體開始生長發(fā)育，蛋殼膜和菌絲膜形成一體、蛋清營養(yǎng)物質(zhì)吸收稀薄如水樣、蛋黃顏色的改變以及噴霧干燥蛋蟲草粉重量等綜合比較，在試驗(yàn)前生長發(fā)育不明顯，到12日齡生長發(fā)育明顯，尤其12～18日齡時(shí)生長發(fā)育良好。但隨著日齡的增加，雞蛋內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)被菌種消耗殆盡，24日齡和對照組、6日齡、12日齡之間差異不明顯，應(yīng)該是菌絲體逐漸出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，與張楊等[20]研究關(guān)于北蟲草接種時(shí)間對培養(yǎng)基的要求基本一致（表4、圖5和圖6）。

4 ?結(jié)論

北蟲草天然資源數(shù)量很少，再加上大量采挖已日漸枯竭，傳統(tǒng)人工培養(yǎng)基以大米、小麥、高粱、蠶蛹粉等為主，各營養(yǎng)成分有限，對培養(yǎng)條件要求苛刻、工藝復(fù)雜、周期長，而雞蛋中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物，能滿足北蟲草菌的營養(yǎng)需求，使之開發(fā)成具備多種營養(yǎng)的單一培養(yǎng)基質(zhì)，接種后培養(yǎng)條件簡單、周期短、方法簡便，同時(shí)我國產(chǎn)蛋量大、價(jià)廉易得，因此將北蟲草菌接種在雞蛋內(nèi)培養(yǎng)適合工業(yè)化批量生產(chǎn)。

通過試驗(yàn)將北蟲草菌種接種在無公害雞蛋內(nèi)，以在尿囊腔內(nèi)接種0.3 mL培養(yǎng)18日齡時(shí)，菌絲體變化明顯、蛋殼膜和菌絲膜形成一體、蛋清營養(yǎng)物質(zhì)吸收稀薄如水樣，噴霧干燥蛋蟲草粉質(zhì)量增加顯著，為北蟲草培養(yǎng)新模式提供技術(shù)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，為研制北蟲草提供新的思路和方法，為新型免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)提供更多來源。

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