楊成蓮，段鱈蕓，鐘桂書(shū)

腫瘤細(xì)胞是一群異常增殖的細(xì)胞，與正常細(xì)胞的能量供應(yīng)方式不同，其糖代謝的特征性改變是有氧糖酵解，即Warburg 效應(yīng)[1]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞間存在代謝共生[2]。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)迅速、血管生成不足使得腫瘤內(nèi)存在乏氧區(qū)與富氧區(qū)。乏氧區(qū)腫瘤細(xì)胞以糖酵解方式供能為主，將丙酮酸生成乳酸。而富氧區(qū)主要采用氧化磷酸化方式產(chǎn)能，通過(guò)乳酸穿梭機(jī)制利用乏氧區(qū)產(chǎn)生的乳酸，將乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸再進(jìn)入三羧酸循環(huán)產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）。乳酸脫氫酶（LDH）由A、B 亞基(LDH-A、LDH-B)構(gòu)成的四聚體酶，它是糖酵解過(guò)程中丙酮酸與乳酸相互轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，也是丙酮酸生成之后惟一的酶。丙酮酸是進(jìn)入糖酵解途徑還是三羧酸循環(huán)，與LDH的活性有關(guān)[3]，因此LDH 成為腫瘤代謝研究的關(guān)鍵點(diǎn)。當(dāng)組織發(fā)生惡變時(shí)，LDH 與腫瘤的增生、侵襲呈明顯相關(guān)性，目前已在乳腺癌等多種腫瘤中檢測(cè)到LDH 的活性明顯升高，且在不同的腫瘤中LDH-A和LDH-B 的表達(dá)存在差異[4]。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)LDH-A、LDH-B 在皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma,CSCC）組織中的表達(dá)水平，探討LDH-A、LDH-B 在CSCC 進(jìn)展中發(fā)揮的作用，為其進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 收集西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科2013 年01 月—2017 年12 月確診的CSCC 88 例，男42 例,女46 例，年齡42～93 歲，平均年齡（62.55±14.11）歲,病程1 個(gè)月～30 年，平均病程（31.74±4.10）個(gè)月，均無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。按世界衛(wèi)生組織（WHO）分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)將CSCC 劃分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，Ⅰ～Ⅱ級(jí)為高分化CSCC（40 例），Ⅲ～Ⅳ級(jí)為低分化CSCC（48 例）。腫瘤部位：頭面部70 例，四肢8 例，頸部6 例，胸腹部4 例。所有石蠟標(biāo)本均經(jīng)組織病理檢查明確診斷，所有患者為首次就診，術(shù)前未接受過(guò)放化療、光動(dòng)力治療及其他特殊治療，且未并發(fā)內(nèi)臟腫瘤。取該院外科手術(shù)切除的正常皮膚組織40 例作為對(duì)照組，男20 例，女20 例，年齡22～72 歲，平均年齡（64.18±13.02）歲，其中頭面部32 例，四肢4 例，頸部2 例，胸腹部2 例。

1.1.2 試劑 鼠抗人LDH-A 多克隆抗體、鼠抗人LDH-B 多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司），MaxVisionTMHRP 免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司）。LDH-A 抗體工作液濃度為1:100，LDH-B 抗體工作液濃度為1:200。

1.2 方法

石蠟標(biāo)本3 μl 連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、水化、檸檬酸鹽高壓煮沸法修復(fù)抗原、3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物、抗體孵育。采用免疫組化Maxvision 法，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。DAB 顯色、蘇木精復(fù)染。免疫組化染色陽(yáng)性對(duì)照為已確定為陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌組織切片，PBS 代替一抗為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

LDH-A、LDH-B 均以胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性。由2 位以上的有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師對(duì)切片進(jìn)行隨機(jī)觀(guān)察。每個(gè)標(biāo)本選取免疫染色豐富區(qū)域，在400 放大倍數(shù)下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，按一定順序計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行著色強(qiáng)度和比例評(píng)分：基本無(wú)著色記0 分，淺棕黃色記1 分，棕黃色記2 分，棕褐色記3 分。著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率＜10%記1 分，10%～50% 記2 分，50%～80%記3 分，＞80%記4 分。以上兩項(xiàng)評(píng)分相加：0～2 分或著色細(xì)胞數(shù)＜10%為（-），3 分 為（+），4～5 分 為（++），6～7 分為（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)分析CSCC 組與對(duì)照組之間陽(yáng)性表達(dá)率，采用等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn)分析腫瘤分級(jí)與陽(yáng)性表達(dá)程度的差異，采用Spearman 相關(guān)性檢驗(yàn)分析兩樣本相關(guān)性。以α=0.05 為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LDH-A、LDH-B 在CSCC、正常皮膚組織中的表達(dá)

LDH-A、LDH-B 蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。正常皮膚組織的基底層和附屬器細(xì)胞質(zhì)僅少量表達(dá)LDH-A 和LDH-B，呈淺棕黃色顆粒。CSCC 細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)LDH-A、LDH-B 呈現(xiàn)不同程度表達(dá)（圖1，圖2），且明顯高于正常皮膚組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2LDH-A=35.939，χ2LDH-B=31.709，P＜0.05）。LDH-A、LDH-B 在CSCC 中的表達(dá)在患者性別、年齡、病程、腫瘤大小、部位、數(shù)目上的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 LDH-A、LDH-B在CSCC組織和正常皮膚組織中的表達(dá) [例(%)]

圖1 LDH-A在正常皮膚組織和CSCC中的表達(dá)（MaxVision法×200）

圖2 LDH-B在正常皮膚組織和CSCC中的表達(dá)（MaxVision法×200）

2.2 高分化與低分化CSCC 組織中LDH-A、LDH-B蛋白的表達(dá)情況

LDH-A 在低分化CSCC 組織中的陽(yáng)性表達(dá)更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.641，P＜0.05）。而LDH-B 在高分化CSCC 組織中的陽(yáng)性表達(dá)更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.387，P＜0.05），見(jiàn)表2，表3。

表2 高分化與低分化CSCC組織中LDH-A的表達(dá) [例(%)]

表3 高分化與低分化CSCC組織中LDH-B的表達(dá) [例(%)]

2.3 LDH-A 和LDH-B 蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman 等級(jí)相關(guān)分析表明，CSCC 組織中LDH-A 和LDH-B 蛋白表達(dá)并無(wú)相關(guān)性（r=0.079，P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 CSCC組織中LDH-A和LDH-B表達(dá)的相關(guān)性 [例(%)]

3 討論

腫瘤細(xì)胞的代謝特征之一就是有氧糖酵解，一分子葡萄糖雖然只能產(chǎn)生兩分子ATP，但效率極高。高度惡性的腫瘤細(xì)胞其糖代謝率可達(dá)正常細(xì)胞200倍以上，因此腫瘤組織內(nèi)能產(chǎn)生與正常組織相當(dāng)?shù)腁TP 的量[5]。目前有氧糖酵解的機(jī)制尚未闡明，可能與Ras 和c-Myc 等癌基因激活或抑癌基因失活等多靶點(diǎn)調(diào)控有關(guān)，通過(guò)直接上調(diào)并激活糖酵解相關(guān)酶和抑制三羧酸循環(huán)通路中的酶，包括上調(diào)編碼LDH 的基因表達(dá)和蛋白修飾[6]。另一方面，乳酸作為糖酵解的產(chǎn)物在維持腫瘤能量供應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞生成、血管形成，促進(jìn)腫瘤增生和侵襲也起重要作用。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞間以及腫瘤細(xì)胞與周?chē)g質(zhì)細(xì)胞間均存在乳酸穿梭機(jī)制[7,8]。乳酸可能是比葡萄糖更重要的能量運(yùn)載體[9]，因此LDH 受到進(jìn)一步關(guān)注。

LDH-A、LDH-B 由不同基因編碼，分別定位于11 號(hào)和12 號(hào)染色體。A 亞基主要催化丙酮酸生成乳酸，B 亞基則促進(jìn)乳酸向丙酮酸轉(zhuǎn)化。兩種亞基按不同比例組成LDH1～LDH5 5 種同工酶。研究表明，LDH-A 在惡性黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、大腸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),并與腫瘤大小、惡性程度呈正相關(guān)[10]。抑制LDH-A 基因表達(dá)，能抑制乳腺癌的糖酵解，明顯降低腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力，可能與腫瘤PI3K-AKT-mTOR 信號(hào)通路激活有關(guān)，激活的mTOR 促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1a）表達(dá)，HIF-1a 表達(dá)增強(qiáng)能上調(diào)LDH-A 表達(dá)，下調(diào)LDH-B表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)糖酵解進(jìn)行[11]。目前有關(guān)LDH-B 的研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、髓母細(xì)胞瘤中已檢測(cè)到高表達(dá)的LDH-B,但在呈現(xiàn)高度惡性的前列腺癌及肝癌細(xì)胞中卻少量表達(dá)，可能與LDH-B 基因啟動(dòng)子的甲基化有關(guān)[12,13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LDH-A、LDH-B 在CSCC中的表達(dá)明顯高于正常皮膚組織，可能與腫瘤高度活躍的糖代謝有關(guān)。此外，低分化的CSCC 組織中LDH-A 的表達(dá)明顯高于高分化組織，提示升高的LDH-A 水平與CSCC 的惡性程度有關(guān)。相比之下，低分化的CSCC 惡性程度更高，增生速度更快，易造成血管生成不足。出現(xiàn)局部氧供、葡萄糖供應(yīng)不足。腫瘤細(xì)胞為適應(yīng)組織內(nèi)的低氧微環(huán)境，LDH-A 基因轉(zhuǎn)錄能被HIF-1a 增強(qiáng)，傾向于糖酵解方式供能，加速葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗醄14]。相反，高分化的CSCC 組織中能檢測(cè)到更高的LDH-B 表達(dá)，可能由于LDH-B能催化乳酸的再利用及促進(jìn)有氧氧化的進(jìn)行。有趣的是CSCC 組織中LDH-A 和LDH-B 表達(dá)并無(wú)相關(guān)性?？紤]與腫瘤組織中代謝是動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，受到血供、氧供等腫瘤微環(huán)境影響，而A、B 亞基的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和修飾過(guò)程受到多基因及信號(hào)通路調(diào)控等有關(guān)。有研究表明，CSCC 腫瘤面積＞2 cm2者轉(zhuǎn)移率、復(fù)發(fā)率增高[15]，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中并未發(fā)現(xiàn)LDH-A 表達(dá)水平與腫瘤大小相關(guān)，這可能與CSCC 相較于惡性黑素瘤等腫瘤惡性程度低。本研究所選標(biāo)本尚無(wú)淋巴結(jié)及全身轉(zhuǎn)移，隨后可以擴(kuò)大樣本量及對(duì)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行深入研究。

Liu 等[16]對(duì)前列腺癌患者長(zhǎng)達(dá)15 年的隨訪(fǎng)發(fā)現(xiàn)，癌組織中高LDH-A 水平和低LDH-B 水平的患者臨床預(yù)后更差。因此，LDH-A 和LDH-B 的表達(dá)對(duì)評(píng)價(jià)CSCC 的發(fā)展有重要的臨床價(jià)值，二者在CSCC 中的作用及調(diào)控的機(jī)制還需進(jìn)一步闡明。