楊 夏，吳 濤

0引言

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)是一種起源于視網(wǎng)膜胚胎性核層細(xì)胞的惡性腫瘤，其患病群體主要為5歲以下的嬰幼兒。相關(guān)流行病學(xué)研究顯示，RB在5歲以下兒童中的發(fā)病率為11.8/100萬，占同齡兒童惡性腫瘤的6.1%[1]。RB的死亡率在歐美發(fā)達國家為3%～5%，而在亞洲與非洲則高達40%～70%[2]。RB嚴(yán)重危害患兒的視力、生活質(zhì)量乃至生命。近年來，隨著腫瘤綜合治療相關(guān)技術(shù)的革新與進步，趨于更微觀層次的分子靶向治療顯示出了愈發(fā)理想的治療前景，其中小分子核糖核酸(microRNA，miRNA)對其靶基因表達的調(diào)控對腫瘤發(fā)生及病情進展的影響逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點之一。新近研究表明，miR-130b在不同腫瘤組織中均存在表達異常的情況，且與腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移、化療抵抗以及多項不良預(yù)后具有密切關(guān)聯(lián)[3-6]。但miR-130b是否對RB也同樣存在某種影響，目前國內(nèi)外就此方面研究相對較少。本研究通過檢測miR-130b在RB組織中的表達水平并初步探討其可能性促癌機制，以期為RB的發(fā)生機制提供新的理論基礎(chǔ)，繼而為臨床治療開辟新思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本采集選取2013-07/2017-08期間在我院眼科中心接受眼球摘除術(shù)治療的RB患兒29例29眼，其中男16例16眼，女13例13眼；年齡3mo～6歲，平均2.5±0.8歲。所有患兒在入選本研究前均未接受過化療與局部放療。取每例患兒RB癌組織及相應(yīng)癌旁組織(距腫瘤邊緣1～2cm范圍內(nèi)組織)標(biāo)本，每份標(biāo)本均經(jīng)我院病理科進行病理檢查確診。將收集到的標(biāo)本放至液氮中保存待用。相關(guān)標(biāo)本的收集程序、方法及后續(xù)各項實驗方案均已通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查，入選患兒家屬均簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑和儀器主要試劑：人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologuedeleted on chromosome 10，PTEN)過表達及對照、PTEN干擾及對照購自RiboBio公司；RNeasy Mini Kit(50)試劑盒購自MULTI SCIENCES公司、mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Ferments公司；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自德國Qiagen公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；Akt、p-Akt 308、p-Akt 473兔抗人多克隆抗體購自Bio-Rad公司；Triton X-100購自美國Dow Chemical公司；PTEN抗體購自英國Abcam公司；LipofectamineTM2000 Reagent購自美國Invitrogen公司。主要儀器：5% CO2培養(yǎng)箱371型購自Thermo Fisher公司；低溫超速離心機ALLEGRA X-15R型購自Beckman Coulter公司；倒置熒光顯微鏡Axio Observer A1/D1/Z1型購自德國Carl Zeiss公司；電泳儀、濕轉(zhuǎn)儀、搖床購自美國Bio-Rad公司；熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司。

1.2方法

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1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染采用含10%胎牛血清的RMPI-1640與MCDB-131培養(yǎng)基分別于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)人RB細(xì)胞系HXO-Rb44與Y79(上海子實生物)及人正常視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞系A(chǔ)CBRI-181(ATCC)。采用miR-130b mimics對HXO-Rb44細(xì)胞中的miR-130b進行過表達，對照物為miR-NC。采用anti-miR-130b對Y79細(xì)胞中的miR-130b進行下調(diào)處理，對照物為anti-miR-NC。分別采用miR-NC+PTEN-NC、miR-130b mimics+PTEN-NC、miR-NC+PTEN、miR-130b mimics+PTEN對HXO-Rb44細(xì)胞進行共轉(zhuǎn)染。分別采用anti-miR-NC+siSCR、miR-130b inhibitor+siSCR、anti-miR-NC+siPTEN、miR-130b inhibitor+siPTEN對Y79細(xì)胞進行共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)條件同前。

1.2.2qRT-PCR檢測參照試劑盒說明書提取總RNA(包括miRNA)，根據(jù)試劑盒操作說明檢測組織樣本及相關(guān)細(xì)胞系miR-130b表達水平，以U6小RNA為內(nèi)參對照，采用2-△△Ct相對定量法處理數(shù)據(jù)。采用SYBR Green熒光定量PCR混合液與GAPDH為內(nèi)參檢測PTEN基因的相對表達量，同時采用2-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)計算PTEN靶基因的相對表達量。相關(guān)引物序列分別為：miR-130b(5’- CAGGCAAGAGAAAGGGCA -3’)；PTEN(5’-TGCAGATAATGACAAG-3’)；GAPDH(5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’)；U6(5’-CTCGCTTCGGCAGCAC-3’)。

1.2.3WesternBlot檢測采用RIPA裂解緩沖液(含1% PMSF)裂解總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白煮沸變性，上樣40μg/孔。12% SDS-PAGE電泳分離，恒流條件下PVDF轉(zhuǎn)膜。采用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液在37℃條件下封閉2h。一抗(1∶1000)孵育，4℃過夜。TBST洗膜3次。二抗(1∶5000)孵育，37℃ 2h。TBST洗膜3次。最后采用ECL免疫印跡發(fā)光試劑盒進行檢測。

1.2.4免疫熒光染色分析重懸對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度約為1×105/mL，平皿(d=3.5cm)接種后于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后去培養(yǎng)基，預(yù)溫PBS(37℃)清洗3次。采用10%甲醛固定40min，PBS清洗3次，每次10min。采用濃度為0.2% Triton X-100透化處理5min，清洗。采用5% BSA(500μL/孔)室溫封閉1h。加一抗(1∶100)，放置到濕盒內(nèi)4℃過夜，復(fù)溫45min后采用PBS搖洗3次；加二抗(1∶400)，37℃避光放置30min，PBS搖洗3次。室溫條件下DAPI染色5～10min，去DAPI后采用PBS避光搖洗3次。最后進行熒光顯微鏡鏡檢。

1.2.5雙熒光素酶報告基因試驗合成序列miR-130b：3’-GGAAAGUAGUAACGUGA-5’，攜帶PTEN-3’非翻譯區(qū)(3’UTR)目的片段的質(zhì)粒：野生型PTEN 3’UTR(PTEN 3’UTR WT)：5’-UCCUACCCCUUUGCACU-3’、突變型PTEN3’UTR(PTEN 3’UTR MUT)：5’-UCCUACCCCUUAGGAGU-3’。將后兩種序列分別構(gòu)建到pmirGLO雙螢光素酶報告基因載體質(zhì)粒上。取對數(shù)生長期HEK293T細(xì)胞，以每孔7.5×104個細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1d。更換為無血清培養(yǎng)基。將miR-130b mimics及miR-130b control分別與PTEN的空質(zhì)粒(PTEN-NC)、野生質(zhì)粒(wt-PTEN)以及突變質(zhì)粒(mut-PTEN)進行組合，共計6組，每組包括4個副孔。將100μL無血清培養(yǎng)基、2μL LipofectamineTM2000、20pmol RNA(1μL)、0.4μg質(zhì)粒(4μL)等物質(zhì)加至EP管內(nèi)并配勻，室溫靜置20min再分別加至相應(yīng)孔板。根據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒說明書，48h后加20μL PLB裂解液，裂解后加到96孔板，加100μL熒光素酶檢測試劑Ⅱ(luciferase assay reagentⅡ，LARⅡ)后進行螢火蟲熒光酶活性檢測。最后加100μL Stop & Glo?試劑湮滅螢火蟲熒光素酶活性并激活海腎熒光素酶活性，檢測miR-130b mimics+wt-PTEN與miR-130b mimics+mut-PTEN組的螢火蟲熒光素酶活性改變情況。

圖1qRT-PCR檢測miR-130b在人RB癌組織和癌旁組織及人RB細(xì)胞系中的表達A：miR-130b在人RB癌組織與癌旁組織中的表達(aP<0.05vs癌旁組織)；B：miR-130b在ACBRI-181、HXO-Rb44、Y79三種細(xì)胞系中的表達(aP<0.05vsACBRI-181)；C：miR-130b在經(jīng)miR-130b mimics轉(zhuǎn)染后的HXO-Rb44細(xì)胞中的表達(aP<0.05vsHXO-Rb44)；D：miR-130b在經(jīng)miR-130b inhibitor轉(zhuǎn)染后的Y79細(xì)胞中的表達(aP<0.05vsY79)。

圖2PTEN在人RB癌組織和癌旁組織中的表達及其與miR-130b的相關(guān)性A：qRT-PCR檢測PTEN在人RB癌組織與癌旁組織中的表達(aP<0.05vsRB癌組織)；B：miR-130b表達與PTEN表達的相關(guān)性。

2結(jié)果

2.1miR-130b在人RB癌組織和癌旁組織及人RB細(xì)胞系中的表達miR-130b在人RB癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織(t=3.273，P=0.002，圖1A)。與ACBRI-181細(xì)胞比較，miR-130b在HXO-Rb44與Y79細(xì)胞中的表達水平顯著增高，其中miR-130b在Y79細(xì)胞中的表達水平最高(3組比較：F=549.619，P<0.001；ACBRI-181vsHXO-Rb44：t=-23.208，P<0.001；ACBRI-181vsY79：t=-32.109，P<0.001；HXO-Rb44vsY79：t=-8.901，P<0.001，圖1B)。HXO-Rb44細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-130b mimics后，miR-130b表達水平顯著增高(3組比較：F=1725.913，P<0.001；miR-NCvsHXO-Rb44：t=-0.489，P=0.626；HXO-Rb44vsmiHXO-Rb44：t=-51.124，P<0.001；miR-NCvsmiHXO-Rb44：t=-50.635，P<0.001，圖1C)。Y79細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-130b inhibitor后，miR-130b表達水平顯著降低(3組比較：F=1427.198，P<0.001；Y79vsanti-miR-NC：t=2.159，P=0.034；Y79vsinY79：t=47.307，P<0.001；anti-miR-NCvsinY79：t=45.148，P<0.001，圖1D)。

2.2PTEN為miR-130b的靶基因

2.2.1PTEN在人RB癌組織和癌旁組織中的表達及其與miR-130b的相關(guān)性與人RB癌組織比較，PTEN在其癌旁組織中的表達水平顯著增高(t=-4.329，P<0.001，圖2A)。相關(guān)性分析顯示，miR-130b表達水平與PTEN表達水平呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.5608，P<0.001，圖2B)。

2.2.2PTEN在人RB細(xì)胞系中的表達Y79細(xì)胞中PTEN mRNA與蛋白的表達水平均顯著低于HXO-Rb44細(xì)胞(qRT-PCR檢測結(jié)果：t=-12.071，P<0.001，圖3A)。過表達miR-130b后的HXO-Rb44細(xì)胞中PTEN mRNA與蛋白表達水平均顯著降低，而干擾miR-130b后的Y79細(xì)胞PTEN mRNA與蛋白表達水平均顯著升高(qRT-PCR檢測結(jié)果：miR-NCvsmiHXO-Rb44：t=7.951，P<0.001；anti-miR-NCvsinY79：t=9.588，P<0.001，圖3B、C)。

圖3PTEN在人RB細(xì)胞系中的表達A：qRT-PCR和Western Blot法檢測HXO-Rb44與Y79細(xì)胞中的PTEN表達(aP<0.05vsHXO-Rb44)；B：qRT-PCR和Western Blot法檢測轉(zhuǎn)染后HXO-Rb44與Y79細(xì)胞中的PTEN表達(aP<0.05vsmiR-NC;cP<0.05vsanti-miR-NC)；C：免疫熒光法檢測HXO-Rb44和Y79細(xì)胞中PTEN表達(×400)。

圖4雙熒光素酶報告基因試驗結(jié)果aP<0.05vsmiR-130b mimics+PTEN-NC。

圖5WesternBlot法檢測miR-130b對RB細(xì)胞系PI3K/Akt信號通路表達的影響A：過表達miR-130b對HXO-Rb44細(xì)胞PI3K/Akt信號通路表達的影響(aP<0.05vsmiR-NC)；B：下調(diào)miR-130b對Y79細(xì)胞PI3K/Akt信號通路表達的影響(aP<0.05vsanti-miR-NC)。

2.2.3雙熒光素酶報告基因試驗結(jié)果與miR-130b mimics+PTEN-NC組比較，miR-130b mimics+wt-PTEN的螢火蟲熒光素酶活性大幅度降低(t=7.298，P<0.001)，但miR-130b mimics+mut-PTEN組未發(fā)生明顯改變(t=0.228，P=0.820，圖4)。

2.3miR-130b對RB細(xì)胞系PI3K/Akt信號通路表達的影響過表達miR-130b后的HXO-Rb44細(xì)胞p-Akt 308、p-Akt 473蛋白的表達水平相較miR-NC組均顯著升高(t=-11.724、-9.225，均P<0.001)，總Akt蛋白表達水平無顯著差異(t=-0.773，P=0.443)，見圖5A。下調(diào)miR-130b后的Y79細(xì)胞p-Akt 308、p-Akt 473蛋白的表達水平相較anti-miR-NC組均顯著降低(t=14.260、10.821，均P<0.001)，總Akt蛋白表達水平無顯著差異(t=-1.317，P=0.193)，見圖5B。

2.4PTEN與miR-130b對RB細(xì)胞系PI3K/Akt信號通路表達的影響四種共轉(zhuǎn)染的HXO-Rb44細(xì)胞p-Akt 308、p-Akt 473、PTEN蛋白表達水平有明顯差異(F=83.043、62.943、111.091，均P<0.001)，總Akt蛋白表達水平無明顯差異(F=0.978，P=0.406)；共轉(zhuǎn)染miR-130b mimics+PTEN-NC HXO-Rb44細(xì)胞p-Akt 308與p-Akt 473蛋白表達水平顯著增高(均P<0.05)，PTEN蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；共轉(zhuǎn)染miR-130b mimics+PTEN HXO-Rb44細(xì)胞中，以上三種蛋白表達水平均未發(fā)生明顯改變(均P>0.05)，見圖6A。四種共轉(zhuǎn)染的Y79細(xì)胞p-Akt 308、p-Akt 473、PTEN蛋白表達水平有明顯差異(F=193.123、369.911、274.311，均P<0.001)，總Akt蛋白表達水平無明顯差異(F=0.568，P=0.637)；共轉(zhuǎn)染miR-130b inhibitor+siPTEN Y79細(xì)胞p-Akt 308與p-Akt 473蛋白的表達水平無明顯差異(308：t=0.244，P=0.808；473：t=-0.271，P=0.808)，圖6B。

3討論

RB是當(dāng)前最為常見且危害程度最高的兒童眼內(nèi)惡性腫瘤。隨著RB治療理念的進步，其國內(nèi)治療發(fā)展趨勢正逐步朝發(fā)達國家靠攏，盡量避免行患眼眼球摘除術(shù)或眼眶內(nèi)容物剜出術(shù)。常用的保守治療方法則主要包括放療、經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼ā⒒瘜W(xué)減容療法以及激光光凝等，但各種保守療法均存在不足[7-8]。隨著分子生物學(xué)研究的深入，針對已明確的由腫瘤細(xì)胞內(nèi)部某一個蛋白分子或基因片斷所形成的致癌位點開展分子靶向治療，為改善RB的整體臨床治療效果增加了可能性。

圖6WesternBlot法檢測PTEN與miR-130b對RB細(xì)胞系PI3K/Akt信號通路表達的影響A：PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白在HXO-Rb44細(xì)胞中的表達；B：PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白在Y79細(xì)胞中的表達。

miRNA是一類具有進化高度保守特征的小分子非編碼RNA，約含22個核苷酸，廣泛存在于動植物及某些病毒體內(nèi)。成熟miRNA分子能與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)域進行完全或不完全互補配對，繼而促使靶基因mRNA降解或阻滯蛋白表達[9]。miR-130b家族因被發(fā)現(xiàn)在某些癌癥中發(fā)揮重要作用而受到廣泛關(guān)注，該家族成員包括分別位于人染色體11q12.1與22q11.21上的miR-130a和miR-130b。其中miR-130b在不同類型腫瘤中的作用具有差異性，表現(xiàn)出類似原癌基因或抑癌基因的生物學(xué)功能[10]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-130b在食道癌組織與胃癌組織中呈高表達，能促進腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移或降低凋亡，可視為致癌基因[11-12]；在胰腺癌組織和細(xì)胞中呈異常低表達，能減少腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，可視為抑癌基因[3]。本研究經(jīng)qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-130b在RB癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)，且其在RB細(xì)胞系中的表達水平較正常視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞也顯著增高(P<0.05)。提示miR-130b在RB中可能發(fā)揮促癌作用，故研究miR-130b的靶基因有利于更加明確其在RB中的作用機制。

PTEN為一種位于染色體10q23區(qū)域的具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展均與PTEN結(jié)構(gòu)與功能異常具有密切關(guān)聯(lián)[13-14]。Meng等[15]在肝癌中首次證實了PTEN mRNA 3’UTR可直接與miR-21結(jié)合，繼而使PTEN的抑癌功能被抑制。之后陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中均有不同miRNA與PTEN靶向結(jié)合的情況[16-17]?？梢哉J(rèn)為在這些特定的腫瘤中，表達異常的miRNA參與了PTEN的表達調(diào)控。故本實驗選擇PTEN作為miR-130b在RB作用機制研究的準(zhǔn)靶基因。基于靶基因預(yù)測的假陽性率普遍較高，本研究不僅考察了PTEN在HXO-Rb44細(xì)胞與Y79細(xì)胞中的表達水平以及與miR-130b表達的相關(guān)性，同時也采用了雙熒光素酶報告基因試驗進行證實，結(jié)果表明miR-130b表達水平與PTEN表達水平呈負(fù)相關(guān)性，miR-130b在基因水平與蛋白水平均可對PTEN的表達產(chǎn)生影響，且miR-130b可直接靶向結(jié)合PTEN mRNA 3’UTR。進一步機制則可能與Akt信號通路的激活有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-221/222與miR-22等miRNA分子均在靶向作用PTEN后繼而激活A(yù)kt信號通路產(chǎn)生促癌作用[16-17]。另一項關(guān)于膀胱癌的報道指出，PTEN為PI3K/Akt信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)劑，可將PI3K/Akt通路的調(diào)節(jié)元件作為其潛在的治療靶點[18]。本研究結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)染miR-130b mimics+PTEN-NC的HXO-Rb44細(xì)胞中，p-Akt 308與p-Akt 473蛋白表達水平顯著增高(P<0.05)，PTEN蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，而在共轉(zhuǎn)染miR-130b mimics+PTEN的HXO-Rb44細(xì)胞中，以上三種蛋白表達水平均未發(fā)生明顯改變。提示在RB中，miR-130b也可能是通過負(fù)向調(diào)控PTEN對PI3K/Akt信號通路的表達產(chǎn)生影響。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-130b在RB組織及細(xì)胞系中呈高水平表達，miR-130b可能是經(jīng)負(fù)向調(diào)控PTEN對PI3K/Akt信號通路的表達產(chǎn)生影響，最終發(fā)揮促癌作用。miR-130b有望成為RB基因治療的有效分子靶點。