賀家勇，徐 茜，楊晨晨

(1.中國石油烏魯木齊石油化工有限公司職工醫(yī)院外一科，新疆 烏魯木齊 830019；2.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部，新疆 烏魯木齊 830011)

食管癌是人類常見的消化道腫瘤之一，其病理類型分為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(adenocarcinoma，AEC)，其中最常見的是ESCC。在世界范圍內(nèi)，食管癌的發(fā)病率和病死率分別居第8位和第6位[1]。我國是食管癌高發(fā)國家[2]。尋找食管癌的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于食管癌發(fā)病機(jī)制的闡明和早期診斷具有一定意義。微小RNA(microRNA，miR)是在動(dòng)物和植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一類短鏈非編碼RNA，由18～25個(gè)核苷酸組成，第1個(gè)miR于1993年在秀麗隱桿線蟲中被識(shí)別。miR主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，對(duì)機(jī)體的多種生理和病理生理過程發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[3-4]。研究顯示，miR表達(dá)異常與腫瘤惡性潛能、預(yù)后有關(guān)[5-6]，調(diào)節(jié)性miR-26a在腫瘤中具有明顯的雙重功能，當(dāng)作為致癌基因時(shí)，miR-26a作為磷酸酶的拮抗劑張力蛋白同源物和絲裂原活化蛋白激酶，可促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的形成[7-8]。相反，miR-26a可阻止正常肝組織從炎癥發(fā)展為肝細(xì)胞癌[9]，通過腺相關(guān)病毒遞送，減弱細(xì)胞周期蛋白(recombinant cyclin，CCN)D2和CCNE2的表達(dá)[10]。另外，miR-26a在橫紋肌肉瘤和MYC誘導(dǎo)的淋巴瘤中表達(dá)下調(diào)[11-12]。但在食管癌中，miR-26a的作用尚不清楚。本研究分析了miR-26a對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞周期和凋亡的影響，以探討miR-26a在食管癌中的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Eca109由武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心惠贈(zèng)，細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱，采用含青鏈霉素雙抗及體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(fatal bovine serum，F(xiàn)BS)的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2主要試劑與儀器FBS、2.5 g·L-1胰蛋白酶(美國Gibico公司)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)(美國HyClone公司)，細(xì)胞凋亡試劑盒(美國Invitrogen公司)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美國Sigma公司)，RNA酶(北京天根生化科技有限公司)，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(南京碧波生物科技有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(德國Thermo公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞分組與處理將正常培養(yǎng)的人食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞分為正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miR-26a過表達(dá)組。正常對(duì)照組Eca109細(xì)胞正常培養(yǎng)，不加任何類型慢病毒；陰性對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染隨機(jī)序列慢病毒，miR-26a過表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)慢病毒miR-26a。

根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染的預(yù)實(shí)驗(yàn)，得到感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)值為20，根據(jù)廠家提供的病毒滴度換算加入病毒的體積。MOI=20時(shí)，96、6孔板每孔加病毒量分別為2、40 μL。

1.3.2MTT法檢測細(xì)胞增殖能力取各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按每孔3×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)0、24、48、72、96 h時(shí)后，每孔加入5 g·L-1MTT溶液20 μL，恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 h，棄上清液；每孔加入150 μL DMSO。用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測定各孔吸光度值。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期取各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后制備細(xì)胞懸液；緩慢滴入 375 μL -20 ℃預(yù)冷的無水乙醇，1 000 r·min-1離心 5 min，棄去無水乙醇，用PBS洗2～3遍；加入 500 μL 含50 mg·L-1RNA酶的PBS，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min；加入5 μL 1 g·L-1碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液，冰上避光孵育 15 min。用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的周期分布。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后制備細(xì)胞懸液；1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液；將細(xì)胞沉淀加入1×結(jié)合緩沖液100 μL重懸，平均分成3份，加入3個(gè)EP管中，1個(gè)EP管加入5 μL AnnexinⅤ-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)，1個(gè)EP管中加0.4 μL 10 g·L-1PI染色液，另1個(gè)EP管加入AnnexinⅤ-FITC和PI，混勻后避光 5 min；每個(gè)EP管中加入400 μL 1×binding buffer，用200～400目鋼篩過濾，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力取各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。所有細(xì)胞正常培養(yǎng)，換液時(shí)用 10 μL 無菌槍頭在每孔底部距直徑0.5 cm的位置平行畫2條直線。分別于轉(zhuǎn)染后0、24、48、72 h時(shí)拍照，測量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率，劃痕愈合率=(0 h的寬度-測量時(shí)間點(diǎn)的寬度)/0 h時(shí)的寬度。

2 結(jié)果

2.1miR-26a過表達(dá)對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見表1。轉(zhuǎn)染后0、24、48 h，3組細(xì)胞增殖能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。轉(zhuǎn)染后72、96 h，miR-26a過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力低于正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組細(xì)胞增殖能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表13組Eca109細(xì)胞增殖能力的比較

組別細(xì)胞增殖能力(吸光度值)0 h24 h48 h72 h96 h正常對(duì)照組0.414±0.0900.765±0.1491.051±0.2761.516±0.0801.466±0.041陰性對(duì)照組0.451±0.0280.669±0.0460.909±0.1281.397±0.1211.517±0.081miR-26a過表達(dá)組0.463±0.1460.604±0.0580.720±0.0401.068±0.057ab1.179±0.016abF0.8700.2814.25626.61346.688P0.4510.1120.0500.0000.000

注：與正常對(duì)照組比較aP<0.05；與陰性對(duì)照組組比較bP<0.05。

2.2miR-26a過表達(dá)對(duì)Eca109細(xì)胞周期的影響結(jié)果見表2。轉(zhuǎn)染后48 h，miR-26a過表達(dá)組G1、G2期細(xì)胞所占比例高于正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組，S期細(xì)胞所占比例低于正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組G1、S和G2期細(xì)胞所占比例比較差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。

表23組Eca109細(xì)胞周期分布比較

組別細(xì)胞周期G1/%G2/%S/%正常對(duì)照組54.30±1.598.13±1.0735.87±1.71陰性對(duì)照組55.20±8.89a8.03±0.76a36.76±0.15amiR-26a過表達(dá)組62.03±1.29a21.63±13.92a16.33±3.15aF32.365101.81793.226P0.0010.0000.000

注：與miR-26a過表達(dá)組比較aP<0.05。

2.3miR-26a過表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109凋亡的影響轉(zhuǎn)染后72 h，正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miR-26a過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率分別為(2.28±0.24)%、(2.40±0.54)%、(2.31±0.27)%，3組細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.101，P>0.05)。

2.4miR-26a過表達(dá)對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞遷移能力的影響結(jié)果見圖1和表3。轉(zhuǎn)染后0、48 h，3組劃痕愈合距離無明顯差別，劃痕寬度相近，劃痕愈合率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。轉(zhuǎn)染后 72 h，正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組劃痕兩端的細(xì)胞已接近靠攏，miR-26a過表達(dá)組細(xì)胞劃痕寬度仍較寬；miR-26a過表達(dá)組細(xì)胞劃痕愈合率低于正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組細(xì)胞劃痕愈合率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1miR-26a過表達(dá)對(duì)Eca109細(xì)胞遷移能力的影響(倒置顯微鏡，×100)

Fig.1EffectofmiR-26aoverexpressiononthemigrationofEca109cells(invertedmicroscope，×100)

表33組Eca109細(xì)胞劃痕愈合率比較

組別劃痕愈合率0 h48 h72 h正常對(duì)照組1.000±0.0000.697±0.0700.487±0.108陰性對(duì)照組1.000±0.0000.592±0.0140.878±0.016miR-26a過表達(dá)組1.000±0.0000.598±0.2670.192±0.015abF-0.41021.806P-0.6810.002

注：與正常對(duì)照組比較aP<0.05；與陰性對(duì)照組比較bP<0.05；“-”表示無數(shù)據(jù)。

3 討論

有研究顯示，miR在腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞增殖和凋亡、腫瘤血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的作用[13-15]，因此，miR可能作為某些腫瘤新的預(yù)測指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。miR-26a在不同腫瘤中可以扮演抑癌基因和促癌基因的雙重角色，但miR-26a在食管癌中的作用尚不明確。

本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后72、96 h，miR-26a過表達(dá)組細(xì)胞吸光度值低于正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組，提示miR-26a過表達(dá)能降低食管癌細(xì)胞的增殖能力。鄧靜靜[16]將miR-26a特異表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入胰腺癌細(xì)胞株SW-1990和Capan-2，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒法對(duì)細(xì)胞增殖能力進(jìn)行分析顯示，miR-26a過表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用。本研究結(jié)果與其一致，在食管癌細(xì)胞中miR-26a過表達(dá)使食管癌細(xì)胞生長緩慢，miR-26a對(duì)食管癌細(xì)胞的生長起抑制作用。

趙文淘[17]研究顯示，miR-26a可抑制肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其遷移，過表達(dá)miR-26a后BEL-7402和HepG2細(xì)胞體外遷移能力增強(qiáng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a在癌旁組織中高表達(dá)，在肝癌組織中低表達(dá)，有轉(zhuǎn)移的肝癌組織中miR-26a的表達(dá)較無轉(zhuǎn)移肝癌組織高，提示miR-26a可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后72 h，正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組劃痕兩端的細(xì)胞已接近靠攏，而miR-26a過表達(dá)組細(xì)胞劃痕寬度仍較寬，提示miR-26a對(duì)食管癌細(xì)胞的遷移起抑制作用。本研究與趙文淘[17]報(bào)道不一致，推測miR-26a在食管癌發(fā)生、發(fā)展的過程中所起到的作用在不同時(shí)期可能是不一樣的，這有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開始，至下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，細(xì)胞周期可分為間期與分裂期2個(gè)階段。楊璐西等[18]研究了miR-26a對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞周期和增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染后24 h，與對(duì)照組比較，miR-26a高表達(dá)的子宮肌瘤細(xì)胞G1期所占比例增高。本研究結(jié)果顯示，miR-26a過表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，G1期細(xì)胞所占比例高于正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組，S期和G2期細(xì)胞所占比例低于正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組，與楊璐西等[18]報(bào)道的miR-26a在子宮肌瘤細(xì)胞周期中的作用特點(diǎn)一致，提示miR-26a可阻斷人食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞由G1期向S期的過渡。但正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miR-26a過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-26a對(duì)食管癌細(xì)胞的凋亡未產(chǎn)生影響，可能與細(xì)胞類型有關(guān)。

綜上所述，miR-26a可以抑制食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞增殖和遷移，阻斷細(xì)胞由G1期向S期的過渡，但對(duì)細(xì)胞凋亡未產(chǎn)生明顯影響。miR-26a有望成為食管癌的腫瘤標(biāo)志物，但是本研究僅從細(xì)胞水平驗(yàn)證了miR-26a對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞功能的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可收集食管癌患者臨床資料進(jìn)行組織水平的研究，探討miR-26a的表達(dá)與食管癌患者臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系，同時(shí)可進(jìn)一步分析miR-26a對(duì)食管癌發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控作用，為食管癌的治療及預(yù)后判斷提供參考依據(jù)。