孫麗敏 ，蔡芳 ，牛東升 ，孫曉 ，曹艷陽

(1.南陽市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 南陽473000；2.南陽市腫瘤醫(yī)院腫瘤科，河南 南陽 473000)

卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)較為常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位居婦科生殖道腫瘤第三位。研究表明卵巢癌解剖位置過深、起病隱匿、早期癥狀不典型且對該病缺乏應(yīng)有的流行病調(diào)查和早期診斷措施，造成卵巢癌早期診斷率低下、誤診率較高。一旦確診，70%患者即處于晚期，其預(yù)后不良[1，2]。目前關(guān)于該病治療以腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)為主、輔以鉑類藥物和紫杉醇進(jìn)行全身化療，其中75%患者可以完全緩解，但最終會出現(xiàn)60%～70%的近期或遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率，即復(fù)發(fā)性卵巢癌[3，4]。研究表明關(guān)于復(fù)發(fā)性卵巢癌的初次治療會對多數(shù)藥物產(chǎn)生耐藥，特別是鉑類藥物，二次手術(shù)或化療等方法均難以達(dá)到臨床治愈的目的，所以探尋一種新的治療方法具有重要臨床價值[5]。但目前有關(guān)復(fù)發(fā)性卵巢癌治療尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各個地區(qū)則是按照自己的治療原則和用藥經(jīng)驗選取相應(yīng)的治療方法，但再次治療并不能達(dá)到真正的治愈目的，而是盡可能的延長患者無進(jìn)展生存期、總體生存期及改善患者生存質(zhì)量等[6，7]。近年來隨著醫(yī)學(xué)發(fā)展，出現(xiàn)了生物靶向治療，該方法以惡性腫瘤病理異常分子為靶點(diǎn)，通過與靶分子特異結(jié)合的抗體配體，利于阻斷或封閉腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中具有決定性作用的生長因子或激酶產(chǎn)生，有助于對腫瘤新生血管產(chǎn)生破壞作用，起到導(dǎo)向治療的效果，為復(fù)發(fā)性卵巢癌的治療提供了新思路與新方法[8]。但關(guān)于該方面的研究鮮有報道[9]，不利于復(fù)發(fā)性卵巢癌治療。本研究選取貝伐珠單抗治療復(fù)發(fā)性卵巢癌且試圖探明與B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白 （Bcl-2）、Bcl-2相關(guān) X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表達(dá)的相關(guān)性，旨在提高復(fù)發(fā)性卵巢癌治療效果、明確貝伐珠單抗作用機(jī)理，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年2月至2017年10月南陽市第二人民醫(yī)院復(fù)發(fā)性卵巢癌患者148例，入選標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合復(fù)發(fā)性卵巢癌診斷標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)組織病理學(xué)證實或影像學(xué)證據(jù)確診。⑵距離上次化療停止時間6～12個月。⑶病理分期Ⅱ～Ⅳ期且預(yù)期生存期3個月以上。⑷美國東部腫瘤協(xié)助組評定的活動狀態(tài)評分0～2分。⑸腫瘤無出血病史。⑹簽署知情同意書，自愿參加。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴精神疾病、溝通障礙。⑵心肺肝腎功能嚴(yán)重異常。⑶卵巢癌合并其他惡性腫瘤及傳染性疾病。⑷妊娠及哺乳期女性。⑸既往接受過分子靶向干預(yù)。⑹急慢性感染。⑺未遵循本研究規(guī)定及因不良反應(yīng)退出的病例。年齡34～68歲，病理類型：漿液性癌129例、子宮內(nèi)膜樣癌11例、混合性癌8例，分期：Ⅱ期26例、Ⅲ期113例、Ⅳ期9例，復(fù)發(fā)灶直徑：≤5cm95例、＞5cm53例，復(fù)發(fā)灶數(shù)量：單發(fā) 57例、多發(fā)91例。按照奇偶法，將納入患者分為觀察組和對照組（每組74例），比較兩組患者年齡、病理類型、分期、復(fù)發(fā)灶情況等一般資料，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理要求，經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法 對照組采用常規(guī)化療方法，即多西他賽+奈達(dá)鉑，其中多西他賽注射液（生產(chǎn)廠家：深圳萬樂藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H2052067，規(guī)格0.5mL：20mg/瓶）75mg/m2，第一天使用；注射用奈達(dá)鉑（生產(chǎn)廠家：南京先聲東元制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字 H20030884，規(guī)格 10mg/支）80mg/m2，化療第二天使用，每三周為一次化療周期，化療前常規(guī)采用地塞米松（生產(chǎn)廠家：鄭州卓峰制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字 H41020056，規(guī)格 1ml：2mg/瓶支）和鹽酸格拉司瓊分散片（生產(chǎn)廠家：廣西浦北制藥廠，國藥準(zhǔn)字H20020303，規(guī)格1mg/片）；根據(jù)患者體表面積計算多西他賽和奈達(dá)鉑使用劑量，常規(guī)予以兩個化療周期。

觀察組采用貝伐珠單抗聯(lián)合常規(guī)化療方法，貝伐珠單抗注射液（生產(chǎn)廠家：上海羅氏制藥有限公司，批準(zhǔn)文號HK-59450，規(guī)格4ml：100mg/瓶）7.5mg/kg+0.9%氯化鈉注射液（生產(chǎn)廠家：四川科倫藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20056626，規(guī)格250ml/瓶）250ml于化療前60min內(nèi)輸注完畢；化療方法同對照組，常規(guī)予以兩個周期。兩組患者治療期間加強(qiáng)血尿糞常規(guī)、心肺肝腎功能、凝血功能和腫瘤標(biāo)志物監(jiān)測，確保治療順利進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察和記錄兩組患者治療前后實體瘤大小、血清糖類癌胚抗原 125（CA125）、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)和不良事件及分級。

其中實體腫瘤大小：采用德國西門子Biograph TruePoint 64PET/CT檢查，利用TrueX法重建圖像、層厚3mm獲得橫軸面、矢狀面、冠狀面PET圖像、CT圖像和PET/CT融合圖像；選取病灶放射性濃度最高層面勾畫感興趣區(qū)，系統(tǒng)自動測量病灶最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值，予以定量分析。CA125測定：于清晨抽取患者肘部靜脈血5ml，以3000r/min離心10min，分離血清，采用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（美國雅培公司生產(chǎn)，型號Architect i2000），利用雙抗體夾心ELISA法檢測 （試劑盒由武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司提供）。Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白測定：于清晨空腹抽取肘部靜脈血5mL，置入真空靜脈采血管（生產(chǎn)廠家：美國BD公司提供），3.8%乙二胺四乙酸二鉀抗凝?；靹蚝蟪叵拢捎肍icoll-hypzue淋巴細(xì)胞分離液（美國Proteintech公司提供）分離出外周血單個核細(xì)胞（PBMCs），利用0.01mol/L磷酸緩沖液（PBS，武漢博士得生物技術(shù)有限公司提供）洗滌細(xì)胞，用Trizol（美國GIBCO公司提供）提取細(xì)胞總蛋白，通過Infinite F50酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司提供）、采用BCA法測定蛋白濃度 （上海碧云天生物技術(shù)公司提供BCA蛋白濃度測定試劑盒）；制備10%分離膠和5%濃縮膠，各孔加30ug總蛋白予以聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDSPAGE）垂直凝膠電泳分離不同相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)后，轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜（德國Millipore公司提供），于TBST配置的10%脫脂奶粉室溫封閉20min，分別加入 Bcl-2、Bax、Caspase-3 一抗（美國Proteintech公司提供）孵育、于4°C冰箱中過夜；漂洗3次后，加入FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗（由美國Proteintech公司提供）、室溫孵育120min。采用ECL化學(xué)發(fā)光 （超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒由美國Proteintech公司提供），予以顯色、成像。通過Quantity One軟件（美國UVP公司提供）定量分析條帶，將GAPDH作為參考，利用目的蛋白光密度值和GAPDH光密度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)濃度。

表1 兩組患者一般資料分布

1.4 評價標(biāo)準(zhǔn)[10]臨床療效評價標(biāo)準(zhǔn)：⑴按照實體腫瘤評價：①完全緩解：腫瘤完全消失且持續(xù)四周以上；②部分緩解：腫瘤長徑總和下降≥50%且無進(jìn)展表現(xiàn)，持續(xù)四周以上；③穩(wěn)定：腫瘤長徑總和下降25%～49%且持續(xù)四周以上；④進(jìn)展：腫瘤長徑總和增加＞50%，或出現(xiàn)新轉(zhuǎn)移灶?？傆行?完全緩解+部分緩解+穩(wěn)定。⑵按照CA125水平評價：①完全緩解：CA125水平不足35U/ml且持續(xù)四周以上；②部分緩解：CA125水平下降50%且持續(xù)四周以上；③穩(wěn)定：CA125水平下降或升高＜25%且持續(xù)四周以上；④進(jìn)展：CA125水平相對之前升高≥25%且持續(xù)四周以上?？傆行?完全緩解+部分緩解+穩(wěn)定。

不良反應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn)[11]：參考世界衛(wèi)生組織關(guān)于“抗癌藥物常見不良反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)”共計四級，0級：無不良反應(yīng)，1級：輕度不良反應(yīng)，2級：中度不良反應(yīng)，3級：重度不良反應(yīng)，4級：危及生命評價。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用（）表示，計數(shù)資料采用例數(shù)或百分比表示，兩組獨(dú)立、正態(tài)、方差齊性資料組間比較采用t檢驗，等級資料組間比較采用秩和檢驗，樣本率比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療效果構(gòu)成比 按照實體瘤標(biāo)準(zhǔn)，觀察組治療完全緩解率、總有效率均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。按照CA125標(biāo)準(zhǔn)，觀察組治療完全緩解率、總有效率均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.2 兩組患者治療前后Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)比較 治療后，觀察組Bcl-2表達(dá)低于對照組，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表 3。

2.3 兩組患者不良反應(yīng)構(gòu)成比 觀察組不良反應(yīng)構(gòu)成比與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。 見表 4。

3 討論

研究表明復(fù)發(fā)性卵巢癌治療尚無統(tǒng)一方法和統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但多數(shù)專家認(rèn)為該病的治療既需考慮以往治療狀況，又要根據(jù)患者意愿、完全緩解期和生存質(zhì)量等方面制定個體化的治療方法。如手術(shù)中的二次腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)能有效根除復(fù)發(fā)腫瘤、減輕腫瘤負(fù)荷，為深入治療創(chuàng)造條件，但手術(shù)風(fēng)險大，患者基礎(chǔ)條件要求高，對部分患者而言應(yīng)慎重選取[12，13]。放化療被臨床視為重要的治療方法，能有效阻斷腫瘤進(jìn)展、延長緩解期和患者生存期，但放化療副作用大，患者依從性不佳、生存質(zhì)量低下。近年來隨著醫(yī)療技術(shù)不斷進(jìn)展，分子靶向治療成為目前關(guān)注熱點(diǎn)，該方法通過正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)上部分酶表達(dá)和信號傳導(dǎo)通路不同，選擇性的將藥物作用于靶細(xì)胞、組織或器官內(nèi)，從而具備殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。其中單克隆抗體治療含有抗血管內(nèi)皮生長因子的單抗和抗表皮生長因子受體單抗[14，15]。研究表明血管內(nèi)皮生長因子在新生血管生成中具有重要價值，能刺激血管生長且提升血管通透性，利于新生血管網(wǎng)絡(luò)形成而能促進(jìn)腫瘤生長與侵襲[16]，為復(fù)發(fā)性卵巢癌治療提供了新思路與新方法。

表2 兩組患者治療效果構(gòu)成比（%）

表3 兩組患者治療前后Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)比較

表4 兩組患者不良反應(yīng)構(gòu)成比（%）

基于上述認(rèn)知，本研究采用貝伐珠單抗治療復(fù)發(fā)性腫瘤且觀察Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明貝伐珠單抗治療復(fù)發(fā)性腫瘤效果顯著，能明顯縮小實體瘤大小、降低CA125水平，且優(yōu)于單純化療結(jié)局。究其原因可能是由于貝伐珠單抗是一種重組人類單克隆IgG1抗體，以血管內(nèi)皮生長因子為靶點(diǎn)，通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新血管生成，阻斷了惡性腫瘤生長與轉(zhuǎn)移；且腫瘤血管發(fā)生退化，有助于阻斷腫瘤細(xì)胞生長所需營養(yǎng)供應(yīng)途徑；另外，通過促進(jìn)腫瘤血管正常化，利于降低腫瘤組織間滲透壓，確?；熕幬锵蚰[瘤組織內(nèi)的傳送，使化療效果倍增。本研究結(jié)果還表明采用貝伐珠單抗后，復(fù)發(fā)性卵巢癌患者Bcl-2表達(dá)減弱，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)升高，說明貝伐珠單抗能有效抑制腫瘤發(fā)生與發(fā)展，進(jìn)一步印證了貝伐珠單抗治療復(fù)發(fā)性卵巢癌的有效性。因為文獻(xiàn)資料顯示Bcl-2是早期發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子，通過參與細(xì)胞凋亡能有效抑制腫瘤細(xì)胞死亡而具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生與發(fā)展的作用，且Bcl-2過度表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和與多種化療藥物耐藥性關(guān)系密切[17]；另外Bcl-2能阻斷Bax蛋白對受損線粒體外膜發(fā)揮抗凋亡功效，且可以干擾Caspase-3蛋白活性而阻止細(xì)胞凋亡；Bax則可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，若細(xì)胞過度受損，則表現(xiàn)為調(diào)控Bcl-2蛋白表達(dá)下降、Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2/Bax比例降低；Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶，作為凋亡級聯(lián)反應(yīng)途徑中的重要環(huán)節(jié)，一旦細(xì)胞受到凋亡刺激即會被激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18，19]。因此 Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中占據(jù)重要地位，其表達(dá)與腫瘤分期、分級密切相關(guān)。結(jié)合藥物不良反應(yīng)率，結(jié)果顯示貝伐珠單抗相對安全，利于患者接受。

綜上所述，貝伐珠單抗治療復(fù)發(fā)性卵巢癌療效顯著、安全可靠，且能有效調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)抑制腫瘤發(fā)生與發(fā)展，豐富了復(fù)發(fā)性卵巢癌發(fā)生與發(fā)展機(jī)制學(xué)說，為臨床治療提供了一定參考依據(jù)。